[发明专利]一种用于棒状杆菌基因组编辑的CRISPR系统

说明书

本发明公开了一种用于棒状杆菌基因组编辑的CRISPR系统，其包括：可表达V型CRISPR核酸酶的V型CRISPR核酸酶表达元件，其包含启动子、V型CRISPR核酸酶基因序列、终止子，所述V型CRISPR核酸酶选自Cpf1、c2c1、c2c3；可表达crRNA的crRNA表达元件，其包含启动子、crRNA基因序列；所述crRNA是根据基因组上预期进行定向编辑的靶序列设计的碱基配对序列，所述crRNA用于将V型CRISPR核酸酶引导到基因组上的靶序列，靶序列包含5’‑TTN‑3’等特征的PAM序列作为核酸酶识别位点，其中N表示碱基A、T、C或G。该CRISPR系统可实现基因组的基因突变、基因框内插入或基因片段缺失。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于棒状杆菌基因组编辑的CRISPR系统，特别涉及一种用于谷氨酸棒杆菌基因组编辑的V型CRISPR/Cas系统，尤其涉及一种用于谷氨酸棒杆菌基因组编辑的CRISPR/Cpf1系统。

背景技术

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum，简称为谷棒)是一种从土壤分离出来的高GC含量的革兰氏阳性细菌，用于生产氨基酸。谷氨酸棒杆菌基因组操作工具自上世纪90年代开始开发，策略大致可分为基于同源重组的等位基因交换和单链寡核苷酸重组。经典的基于同源重组的等位基因交换依赖于两个连续的事件，第一步整合到基因组的质粒通过单交换整合到基因组上，第二步在基因组上发生双交换。其中第二步双交换筛选效率可通过一系列反筛标记来提高，比如sacB、rpsLmut、upp或I-sceI。整个过程效率低且费时，并需要辅以相应的特殊条件并配置特殊培养基。基于同源重组的等位基因交换可以和Cre/loxP系统结合用于一步筛选双交换，后续需要将基因组上的筛选标记，通常是抗生素基因删除，同时基因组会残留loxP序列从而引起极性效应。改进的方法是将Cre/loxP系统和I-SceI核酸内切酶结合，可以将基因组残留loxP序列删除，从而实现无痕编辑。单链寡核苷酸重组依赖用于DNA重组和DNA修复的重组蛋白RecT。由于单链重组效率很低，通常需要结合高通量筛选手段，如在细胞内设置可以感受某种产物的生物感应器，并通过流式细胞仪进行筛选。这种单链重组可用于基因组点突变，而没有基因删除或插入的报道。

基于规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关(CAS)的基因组编辑技术已被开发用于众多原核和真核生物。CRISPR/Cas系统在原核生物抗病毒防御中发挥重要功能，分别存在于90％和40％的古细菌及细菌基因组中，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系统被分为两大类(class)共五个类型(type)：其中，第一大类包括I型、III型和IV型；第二大类包括II型和V型，并且II型和V型又分别包含数个亚型。其中II型进行DNA干扰需要一个源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9蛋白。近年来，II型CRISPR/Cas系统被用于高等真核生物中在细胞和生物体水平上实现基因组编辑，在过去的几年里CRISPR/Cas9技术在全球的应用呈爆炸性增长。此系统的工作原理是成熟的crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与反式激活tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，并引导核酸酶Cas9蛋白识别基因组上前间区序列邻近基序(protospacer-adjacentmotif，PAM)，其特征是NGG，N代表任意碱基，从而发生基因组切割。

V型CRISPR/Cas(或表示为CRISPR-Cas)系统中使用的核酸酶包括V-A型CRISPR的核酸酶Cpf1、V-B型CRISPR的核酸酶c2c1和V-C型CRISPR的核酸酶c2c3。其中CRISPR/Cpf1的特征是只由crRNA引导Cpf1识别基因组上胸苷丰富的PAM序列(5’-TTN-3’，N代表任意碱基)，从而发生切割，无需tracrRNA参与。V-B型CRISPR的c2c1核酸酶也可以在crRNA引导下发生基因组切割。