[发明专利]一种用于棒状杆菌基因组编辑的CRISPR系统

权利要求书

1.一种编辑棒状杆菌基因组的方法，包括如下步骤：

使用一种CRISPR双质粒系统，将V型CRISPR核酸酶表达质粒和crRNA表达质粒共转化入棒状杆菌感受态细胞中，或者先将V型CRISPR核酸酶表达质粒转化入棒状杆菌感受态细胞中得到转化子、再将crRNA表达质粒转化入该转化子，培养克隆菌株，实现对棒状杆菌基因组的基因点突变或基因片段缺失；

其中V型CRISPR核酸酶表达元件和crRNA表达元件分别位于不同的质粒上，形成由V型CRISPR核酸酶表达质粒和crRNA表达质粒组成的所述CRISPR双质粒系统，其中所述V型CRISPR核酸酶表达元件包含启动子、V型CRISPR核酸酶基因序列、终止子，所述V型CRISPR核酸酶是Cpf1；所述crRNA表达元件包含启动子、crRNA基因序列；所述crRNA是根据基因组上预期进行定向编辑的靶序列设计的碱基配对序列，所述crRNA用于将V型CRISPR核酸酶引导到基因组上的靶序列，靶序列包含5’-TTN-3’在内的PAM序列作为核酸酶识别位点，其中N表示碱基A、T、C、G中的任意一种；或者

使用一种CRISPR单质粒系统，将一体化CRISPR质粒转化入棒状杆菌感受态细胞中，培养克隆菌株，实现对棒状杆菌基因组的基因片段框内插入或基因片段缺失，

其中所述CRISPR单质粒系统是由所述V型CRISPR核酸酶表达元件和所述crRNA表达元件整合在同一个质粒上而构成的一体化CRISPR质粒，用于V型CRISPR核酸酶和crRNA的共表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌选自谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌、停滞棒杆菌、产氨棒杆菌。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸酶Cpf1选自FnCpf1、LbCpf1、Lb2Cpf1或AsCpf1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，V型CRISPR核酸酶表达质粒或一体化CRISPR质粒上包含筛选标记基因，所述筛选标记基因选自下组：卡纳霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒是谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭质粒。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述V型CRISPR核酸酶表达质粒上包含重组蛋白recT基因。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用CRISPR双质粒系统进行棒状杆菌基因组编辑时，在棒状杆菌中导入覆盖切割区的ssDNA，以使其重组到基因组切口而使靶点不再被crRNA识别、并使其修复基因组的切口。

8.如权利要求1-6中任一项中所述的CRISPR双质粒系统或者CRISPR单质粒系统在原核细胞基因组编辑中的应用，所述原核细胞选自谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌。