[发明专利]一种溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针及其制备方法与应用，属于分析化学技术领域。

背景技术

次氯酸(HClO)是自然界中的多种生物用于防御的天然杀菌剂。在生物细胞中，次氯酸由过氧化氢和氯离子在髓过氧化酶(MPO)的催化作用下产生。作为一种重要的活性氧物种，次氯酸在维持细胞内的氧化还原平衡状态起着非常重要的作用，但是一旦细胞中次氯酸的浓度发生异常，就会引起包括风湿性关节炎、心血管疾病和癌症在内的多种疾病，检测生物体系中次氯酸的浓度已成为一个重要的课题。

文献报道，中性粒(白)细胞发炎的情况下可以每小时产生20-400μM的次氯酸，由于次氯酸的pK_a为7.46，在生物体内，部分次氯酸(HClO)是以次氯酸跟(ClO^-)的形式存在的。与传统的检测方法相比，荧光光谱法作为一种非侵入性检测技术，以其众多的优势。如灵敏度高、选择性好、响应迅速、原位检测、实时监测等。

生物体内广泛存在很多内源性活性物种，活性氧物种是非常重要的一类，而次氯酸只是活性氧家族的一员，在其他干扰活性氧物种的存在的条件下，专一性对体内的次氯酸进行识别，需要探针分子具有较好的抗干扰性。与此同时，对于探针浓度、检测温度、响应时间以及仪器误差都对识别产生影响。目前，多数报道的次氯酸探针为单一荧光强度的变化型探针，比率型探针较少。本专利通过分子结构设计，利用FRET原理，在反应位点增加溶酶体定位基团，设计出比率型识别次氯酸的探针且响应时间非常速度。

发明内容

针对目前次氯酸分子荧光探针检测所面临的问题的现状，本发明通过分子设计，合成出一种具有响应时间快的比率型次氯酸荧光探针。

本发明采用以下技术方案：

一种溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针，该探针分子的分子式为：C₄₉H₅₅N₇O₅，具有如下所示结构：

所述探针随着NaClO当量的增加，该荧光探针在385nm的吸收逐渐降低，而在560nm的吸收逐渐增强，紫外光谱成比率变化。

所述探针在没有加入次氯酸的条件下，以380nm激发波长激发，只有在455nm处有很强的荧光发射，以500nm激发波长激发，没有荧光发射；随着NaClO加入当量的增加，455nm处的荧光强度逐渐减弱，584nm处的荧光强度逐渐增强，荧光光谱成比率变化。

上述的溶酶体靶向次氯酸比率荧光探针的制备方法，它包括以下步骤：

1)将1eq的4-二乙胺基酮酸和1eq的间羟基苯基哌嗪溶于3ml浓硫酸中，90℃加热3小时，冷却到室温，冰浴下，加入4ml高氯酸，得到粗产品，柱层析分离得化合物1；

2)将1eq的化合物1溶于乙醇，滴加10eq的80％水合肼，回流3小时，反应完成后，减压旋干溶剂得粗产品并用柱层析分离后得化合物2；

3)将1eq化合物2和1eq的6-二乙胺基萘羧酸、1eq的HOBt、1eq的EDCI溶于DMF中，室温反应6h，反应完全后，加水，乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，并用柱层析后分离得化合物；

4)将1eq的化合物3溶于氯仿中，向其中滴加3-4滴三乙胺，然后将20μl溴乙酰溴溶于1ml氯仿中，再于0℃条件下缓慢滴加于混合溶液中，滴加完毕后室温反应3-4小时，反应完全后，用二氯甲烷萃取，然后依次水洗、盐水洗、无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，并用柱层析分离得到化合物4；

5)将1eq的化合物4，3eq的碳酸钾，微量碘化钾以及3eq的吗啉溶解在DMF中，室温反应6h，反应完全后，乙酸乙酯萃取，水洗2-3次，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂得到粗产品后，用柱层析得到目标探针化合物，简记为Lyso-HClO。

所述步骤(1)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝20:1。

所述步骤(2)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝20:1。

所述步骤(3)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝30:1。

所述步骤(4)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/甲醇＝20:1。

所述步骤(5)中柱层析的洗脱剂配比为：二氯甲烷/石油醚＝1:1。

上述的次氯酸荧光探针的合成路线如下：