[发明专利]NK细胞培养用培养基添加试剂盒及利用所述试剂盒的NK细胞培养方法

说明书

本发明涉及一种适用于免疫疗法的自然杀伤细胞(Natural Killer cell；NK细胞)培养方法，更具体而言，涉及一种NK细胞培养用培养基添加试剂盒及利用所述试剂盒的NK细胞培养方法，通过培养来自人外周血的淋巴细胞，能够高效地扩增及激活在恶性肿瘤治疗中效果卓越的NK细胞，同时NK细胞所占比例能够得到显著增加。

技术领域

本发明涉及一种适用于免疫疗法的自然杀伤细胞(Natural Killer cell；NK细胞)培养方法，更具体而言，涉及一种NK细胞培养用培养基添加试剂盒及利用所述试剂盒的NK细胞培养方法，通过培养来自人外周血的淋巴细胞，能够高效地扩增及激活在恶性肿瘤治疗中效果卓越的NK细胞，同时NK细胞所占比例能够得到显著增加。

背景技术

免疫疗法，作为从患者的血液中提取自然杀伤细胞(NK细胞：Natural Killercell)、树突状细胞(DC)、B细胞及T细胞等癌症治疗中最重要的免疫细胞之后，利用多种刺激剂，培养强作用于癌症的免疫细胞后，再次注射给患者的方法，由于使用患者自身的血液，因此与现有的化学疗法等相比，副作用小、给药方法也简便，因此近年来活跃地进行对此的研究。

在免疫疗法中被激活的免疫细胞中，尤其NK细胞作为淋巴细胞的一种特征性形态的大颗粒淋巴细胞(LGL，Large granular lymphocytes)，具有杀死被感染的病毒及肿瘤细胞的能力卓越，且不杀死大部分正常细胞的特性，所述NK细胞的抗肿瘤作用通过坏死(necrosis)或细胞凋亡(apoptosis)，或通过同时产生这两种作用机理来实现。NK细胞与IL-2、IL-12及干扰素(Interferon)等细胞因子(cytokine)反应，由此提高细胞毒性(cytotoxicity)、分泌性(secretory)及增殖性(proliferative)机能。在人体中，NK细胞的表现型(phenotype)为CD16(FcγRIII)及CD56，由于细胞表面上没有T细胞受体复合物(TRC，T-cell receptor complex)，因此CD16及CD56作为对于NK细胞的标志物(marker)来应用。

已知这种NK细胞在早期生物防御机制及人体的肿瘤免疫中发挥重要的作用。即，NK细胞没有随主要组织相容性复合体(MHC，Major Histocompatibility Complex)表达的免疫获得过程也能够杀伤特定自体细胞、同种异体细胞、甚至异种癌症细胞，尤其更能够杀死Class1 MHC的表达少或不表达的靶细胞。因此，NK细胞能够有效地杀死不表达MHC的大部分癌症细胞，除此之外能够杀死被一些病毒感染的细胞及伤寒杆菌(salmonella typhi)等细菌。

但是，如此对癌症细胞的杀伤具有卓越作用的NK细胞，即使在正常人体中仅占外周血淋巴细胞的5～15％，尤其在癌症患者的情况下，该比例降至不到1％，因此若无通过免疫疗法的额外的扩增过程，则有效攻击癌症细胞具有局限性。

在激活并增殖免疫细胞，尤其激活并增殖NK细胞的过程中，使用IL-2等细胞因子及CD3等抗体。虽然CD3抗体在现有技术的免疫细胞增殖过程中发挥非常重要的作用，但问题在于，利用该抗体来激活免疫细胞非常苛刻。即，培养免疫细胞时，当前的通常技术主要使用使CD3抗体在烧瓶中固定化并刺激一定时间的方法。但是，对于免疫细胞而言，每个人的感受性不同，且根据细胞培养条件或工作人员的熟练程度，出现非常大的差异。例如，若CD3抗体的刺激少或几乎没有刺激，则免疫细胞不能很好地增殖。另外，若过多刺激，则NK细胞几乎不增殖，而NKT细胞或T细胞大量增殖。在该情况下，尤其T细胞大量增殖，因此很难大量增殖并获得NK细胞。

尤其，若从一开始对CD3抗体施加强刺激，则未成熟祖细胞成熟为T细胞，因此通常实施的现有方法是使用一开始稍微刺激CD3抗体的方法，但多取决于个人差异等周边环境要件，因此难以获得被激活并大量增殖的NK细胞。

因此，现状为，兴起开发免去在现有方法中必须使CD3抗体在烧瓶中固定化后反应一定时间的繁琐，且使NK细胞稳定地扩增，从而能够大量地增殖的新的培养基组合物及培养方法的必要性。

发明内容