[发明专利]酵母细胞

说明书

本发明涉及一种Komagataella属酵母细胞，所述细胞包含可通过解阻遏诱导的甲基营养型酵母细胞的直系同源启动子或其变体，其中所述直系同源启动子是甲基营养型酵母细胞的直系同源甲酸脱氢酶(FMD)启动子。

本发明涉及在酵母细胞中的直系同源启动子的用途。

诸如生物药物或工业相关生物催化剂的重组蛋白最常通过在微生物中进行异源基因表达的方式生产。经常使用大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和丝状真菌并长期将其用于重组蛋白的生产。在过去二十年中，甲基营养型酵母Komagataella(Pichia)pastoris、Komagataella(Pichia)phaffii(Pp)、KomagataellaKurtzmanii、Ogataea(Hansenula)polymorpha(Hp)、Candida boidinii(Cb)和Ogataea(Pichia)methanolica(Pm)已成为有效的替代生产菌株。这些菌株使高细胞密度的异源蛋白实现高速表达成为可能。在上述四个酵母物种中，P.pastoris(Komagataella phaffii)在此期间最长用于异源蛋白生产。

所有甲基营养型酵母均具有严格调控的强启动子，其参与甲醇利用(MUT)基因表达的调控。甲醇利用基因的启动子通常在存在抑制碳源(如葡萄糖)时被抑制，并且在存在甲醇作为碳源时极大地上调。如果抑制碳源被耗竭或在存在非抑制性碳源的条件下，则所述启动子通过解阻遏被活化，因此这种作用的强度在物种之间以及甚至在同一生物体内可能变化极大。例如，与甲醇诱导条件相比，在解阻遏条件下，在P.pastoris GS115(PPpAOX1)中醇氧化酶-1基因的启动子仅具有2-4％的活性。而与此相反的是，与甲醇诱导条件相比，在解阻遏条件下，在H.polymorpha(PHpMOX)中直系同源物基因(甲醇氧化酶，MOX)的启动子具有高达70％的活性。而且在C.boidinii(醇氧化酶1，AOD1)和P.methanolica(甲醇氧化酶1/2，MOD1/2)中的直系同源物基因的启动子也具有类似的行为。

出于操作安全性方面的原因，特别是在大规模工业生产中使用具有毒性和可燃性的甲醇诱导表达的不利的，因此强解阻遏启动子构成了有利的替代方案。因此，最近开发了具有不同解阻遏性质的PPpAOX1变体、替代启动子和新型MUT启动子，以使得能够在工业生产规模上实现无甲醇蛋白表达。由于与甲醇诱导的启动子相比，此类启动子的表达速率通常低很多，因而本发明的一个目的是提供重组蛋白在酵母(如P.pastoris)中可诱导的和无甲醇强过表达替代的可能性。

使用Komagataella属酵母细胞实现了这一目的，所述细胞包含可通过解阻遏诱导的甲基营养型酵母细胞的直系同源启动子或其变体，其中所述直系同源启动子是甲基营养型酵母细胞的直系同源甲酸脱氢酶(FMD)或甲醇氧化酶(MOX)启动子；在这一过程中，在甲基营养型酵母细胞中的直系同源启动子能够在解阻遏条件下控制多肽的表达。

使用Komagataella(Pichia)属酵母细胞也实现了这一目的，所述细胞包含甲基营养型酵母细胞的直系同源甲酸脱氢酶(FMD)启动子和/或甲醇氧化酶(MOX)启动子或者这两种启动子的变体，其中在Komagataella属酵母细胞中直系同源启动子的原始调控性质被保留。

令人惊讶地发现，在其他甲基营养型酵母细胞中也具有能够在解阻遏条件下控制多肽表达的启动子，其优选地不属于Komagataella(Pichia)属，能够在解阻遏条件下控制多肽的表达(例如，与非解阻遏条件相比表达增加)，其也具有与在Komagataella(Pichia)属酵母细胞中相似的性质。