[发明专利]用于连接DNA结合结构域和切割结构域的组合物

说明书

本文公开用于连接DNA结合结构域和切割结构域(或切割半结构域)以形成具有替代性构型的非天然存在的核酸酶的组合物。还描述了制备和使用包含这些接头的组合物的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年2月2日提交的美国临时申请号62/290,065的权益，所述临时申请的公开内容以引用方式整体并入本文。

在联邦资助的研究下进行的发明的权利声明

不适用。

技术领域

本公开涉及基因组和蛋白质工程领域。

背景技术

包含可操作地连接至切割结构域的DNA结合结构域(核苷酸或多肽)的人工核酸酶，诸如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、具有工程化crRNA/tracr RNA('单指导RNA')的CRISPR/Cas系统和/或基于Argonaute系统的核酸酶(例如，来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，被称为'TtAgo’(Swarts等(2014)Nature 507(7491):258-261)，已用于基因组序列的靶向改变。例如，核酸酶已用于插入外源序列，使一种或多种内源基因失活，产生基因表达模式改变的生物体(例如作物)和细胞系等等。参见，例如9,255,250；9,045,763；9,005,973；8,956,828；8,945,868；8,703,489；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公布20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960以及20150056705。例如，核酸酶对(例如，锌指核酸酶，TALEN)可用于切割基因组序列。所述对中的每个成员通常包括连接至核酸酶的一个或多个切割结构域(或半结构域)的工程化(非天然存在的)DNA结合蛋白。当DNA结合蛋白结合其靶位点时，结合那些DNA结合蛋白的切割结构域被定位成使得基因组的二聚化和随后切割可以发生，通常在锌指核酸酶对或TALEN对之间。

已经显示，核酸酶对的切割活性与连接锌指和切割结构域的接头(“ZC”接头)长度、氨基酸组成和靶位点(结合位点)之间的距离(间隙)有关。参见，例如美国专利号9,394,531；8,772,453；7,888,121及8,409,861；Smith等(2000)Nucleic Acids Res.28:3361-3369；Bibikova等(2001)Mol.Cell.Biol.21:289-297；美国公布号20150064789。当使用核酸酶融合蛋白对时，已经在融合蛋白的结合位点相隔5或6个核苷酸(如从每个结合位点的近边所测量)定位时获得用当前可用的ZC接头和切割半结构域进行的最佳切割。参见，例如美国专利号7,888,121。美国专利公布20090305419和20150064789描述通过使用各种接头序列(用于各种间隙间隔)和/或修饰FokI切割结构域的N端残基来连接DNA结合结构域和切割结构域。

然而，仍然需要允许靶向修饰的方法和组合物，其中人工核酸酶可在替代性架构中切割内源基因组序列，并且结合位点隔开为6、7、8个或更多个碱基对。

发明内容