[发明专利]高噪声样品中原位检测核苷酸变体及相关的组合物和方法

说明书

本发明涉及原位检测样品中目标核酸的核酸变异的方法，包括单核苷酸变异、多核苷酸变异或剪接位点。所述方法可以包括如下步骤：使所述样品与检测所述核酸变异或剪接位点的探针以及邻居探针接触；使所述样品与结合所述核酸变异探针或剪接位点探针以及邻居探针的前级放大子接触；以及使所述样品与标签探针系统接触；其中组分的杂交形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有所述核酸变异或剪接位点的目标核酸、探针和放大子；以及原位检测所述样品上来自所述SGC的信号。

本申请要求2015年10月12日提交的美国临时申请NO.62/240,347的权益，通过引用将其全部内容合并在文本中。

本发明一般地涉及核酸检测，更具体地涉及核酸变体的原位检测。

发明背景

近期的研究显示在早先被认为是相互间的克隆的肿瘤细胞中有显著的异质性(Gerlinger et al.,N.Engl.J.Med.366:883-892,2012)，意味着在肿瘤部位或肿瘤活检物中的单个的癌细胞不是同质性的。特别是，相邻的癌细胞常常在DNA或RNA中具有单核苷酸变异(single nucleotide variations，SNVs)。因而精准医疗需要组织活检物中SNV的原位检测，其中细胞结构和内容物必需在分析之后被基本上保留。细胞中复杂的物理化学结构和压倒性数量的非目标核酸和其他分子代表了“高噪声”环境，这可能产生高背景，并且需要高度特异性和高度敏感性的组合，这是现有的原位核酸检测技术未能实现的。

SNV检测需要一组单独的目标探针(target probes，TP)来捕获单个的信号发生复合物(signal-generating complex，SGC)。然而，在美国专利No.7,709,198和8,658,361中公开的早先描述的“双重-Z(double-Z)”探针设计中，多组TP与目标杂交以提供足够数量的SGCs来产生可检测信号。

因而，需要以单细胞水平原位检测单核苷酸变异或其他核酸变异的方法。本发明满足了这一需求，并且还提供了相关的优势。

发明概述

本发明涉及原位检测样品中目标核酸的核酸变异的方法，包括单核苷酸变异或剪接变体等。所述方法可以包括使所述样品与探针和邻近探针接触，所述探针检测所述核酸变异；使所述样品与前级放大子(pre-amplifiers)接触，所述前级放大子分别结合所述核酸变异探针和邻近探针；使所述样品与协作放大子接触，所述协作放大子结合所述前级放大子；以及使所述样品与标签探针系统接触的步骤，其中这些组分的杂交形成信号发生复合物(SGC)，所述信号发生复合物包含具有所述核酸变异的目标核酸、所述探针和所述放大子；以及原位检测所述样品上来自SGC的信号的步骤。本发明还提供了与检测目标核酸的核酸变异相关的样品、组织玻片和试剂盒。

附图的简要说明

附图1显示了用于目标核酸中单核苷酸变异(SNV)的原位检测的信号发生复合物(SGC)的示范性的结构。所述SGC包括单核苷酸变异探针-SP；邻近探针-NP；SP前级放大子-SPM，其含有多个SP协作锚-SPCA；NP前级放大子-NPM，其含有多个NP协作锚-NPCA；协作放大子-COM；标签探针系统-LPC，其可以包含多个标签放大子-LM，其每一个随后可以结合多个标签探针-LP。

附图2A和2B例示了SP和NP的细节和方向。附图2A和2B详细地显示了SP和NP的结构、位置和方向。附图2A显示，SP包含与含有所述SNV的目标序列互补的目标锚定片段(SPAT)、与所述SP前级放大子(SPM)上的片段互补的前级放大子锚定片段(SPAP)；NP包含目标锚定片段(NPAT)，其与含有SNV的目标上的片段相邻的目标序列互补，与所述NP前级放大子(NPM)上的片段互补的前级放大子锚定片段(NPAP)；以及处在SPAT与SPAP之间或NPAT与NPAP之间的任选的间隔区。附图2B说明了对于目标不同方向的SP和NP以及整个信号发生复合物(SGC)的实例。