[发明专利]从血浆中提取蛋白质的方法

说明书

从血浆产生包括α‑1‑蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、白蛋白和其它蛋白质的蛋白质产品的方法包括以下步骤：(1)向血液产品中加入盐产生第一中间产物，其中盐占所述第一中间产物重量的11‑13％；(2)分离所述第一中间产物产生第一上清液和第一糊沉淀；(3)向所述第一中间产物中加入盐制备第二中间产物，其中盐占所述第二中间产物重量的21‑23％；(4)分离所述第二中间产物产生第二上清液和第二糊沉淀；(5)通过亲和层析从所述第二上清液分离第三中间产物；和(6)通过离子交换色谱分离所述第三中间产物产生含有蛋白质产品的洗脱液。本发明的方法有利于简单并且以高产率生产α‑1‑蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、白蛋白和其他蛋白质。

技术领域

本发明的领域为用于提高α-1-蛋白酶抑制剂(也称为α-1抗胰蛋白酶)或其他蛋白质产品的纯度和产量的改进方法。

背景技术

以下背景技术讨论包括可能有助于理解本发明的信息，并非承认本申请提供的任何信息为现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明确或暗示引用的出版物是现有技术。

Shanbrom的美国专利第7,297,716号公开了从冷沉淀中分离血液产品(例如，纤维蛋白胶)的方法。Shanbrom的方法使用盐来增加冷沉淀的收率。例如，将重量分数为2-10％的柠檬酸钠加入血液或血浆中。在此浓度下的柠檬酸钠可以灭活和/或抑制致病微生物，防止细胞和蛋白质变性，增加冷沉淀的收率(即使不冷冻)，并有助于去除变性组分。Shanbrom考虑从冷沉淀中分离各种凝血因子，包括纤维蛋白原、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和血小板。然而，Shanbrom未能认识到盐可以被添加到预先冷冻的血液产品中，达到11％(重量)以上的浓度。此外，Shanbrom也不了解可以从任何上清液中提取蛋白质产品，其中就包括由具有11-13％(重量)和21-23％(重量)盐的中间产物形成的上清液。

一种蛋白质产品是α-1-蛋白酶抑制剂(“A1PI”)。A1PI是蛋白酶抑制剂的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的52kDa糖蛋白。通常，A1PI可以保护组织，如肺的弹性组织免受嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的伤害，特别是在炎症部位。A1PI的遗传缺陷可导致肺气肿、慢性阻塞性肺病和肝硬化。如果对A1PI缺陷不进行治疗，可能会引起损伤，而施用A1PI则可以预防这些损伤。

Coan的美国专利4,697,003公开了一种从血浆蛋白质水溶液中分离A1PI的方法。Coan的方法建立在Cohn乙醇分馏技术上，该技术包括解冻新鲜冷冻血浆、去除沉淀物，并且将乙醇分五个阶段添加至浓度约40％。Coan方法的第一步是对Cohn液II+III、液I或冷上清液进行脱盐处理。接着，将脱盐溶液与阴离子交换树脂接触，并且A1PI选择性地结合到树脂上。用淋洗液将A1PI置换至洗脱液。最后，从洗脱液中回收A1PI。然而，乙醇和其他醇可能会产生问题，因为它们容易使期望的蛋白质变性，如A1PI。

Kumpalume等人的美国专利第8,580,931号还公开了分离A1PI的方法，其包括将A+1上清液经历两个金属螯合层析步骤。借用Kistler Nitschmann工艺的术语，A+1上清液为沉淀物A和组分1的组合。然而，A+1上清液的制备还包括加入17-21％(v/v)的乙醇，其可以使如上所述的蛋白质变性。也可参见Thierry的专利DE3874376。

在美国专利第7,879,331号、第7,879,332号和第8,293,242号中，发明人构想了一种盐析工艺，可在从血液产品中提取蛋白质产品时不使用乙醇。

在本发明的主题中，发明人发现了简化的方法：在盐沉淀步骤之前不需要将冷沉淀与去冷沉淀血浆分离。另外，在第一糊沉淀和第二糊沉淀中保留很少蛋白质产品的情况下，可以不用重新溶解糊沉淀并进行进一步的纯化而保持较高的蛋白质产品收率。至于A1PI，发明人发现在22％(重量)的盐浓度下有非常少的A1PI沉淀。鉴于文献教导了A1PI在较高的盐浓度下沉淀，这个结果令人惊讶。由于糊沉淀中很少有A1PI损失，所以可以从第二上清液中获得高收率。因此，工艺可通过除去糊沉淀处理步骤进行改进。