[发明专利]用于表达蛋白质的系统和方法

说明书

本公开涉及用于产生蛋白质的方法和组合物。具体而言，本公开涉及在哺乳动物细胞中产生重组蛋白(例如，药物代谢酶和转运体囊泡)中的电穿孔介导的基因递送。

本申请根据35U.S.C.§119要求于2015年11月25日提交的系列号为62/259,788的美国临时申请的优先权权益，本申请以该申请的内容为基础，并其通过引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本公开涉及用于产生蛋白质的方法和组合物。具体而言，本公开涉及在哺乳动物细胞中产生重组蛋白(例如，药物代谢酶和药物转运体囊泡、微粒体或细胞级分)中的电穿孔介导的基因递送。

发明背景

重组蛋白的表达在研究、工业和制药生物技术行业的许多方面都很重要。例如，药物代谢酶和转运蛋白的表达在药物发现和开发中经常是至关重要的。对于许多这些蛋白质来说，由于需要正确的翻译后修饰(例如糖基化或硅烷化(silation))，哺乳动物细胞中的表达优于原核细胞中的表达。

已知几种用于产生表达重组蛋白的宿主细胞的方法。在最基本的方法中，将含有编码异源蛋白质的基因和适当调节区的核酸构建体引入宿主细胞中并使之整合。引入方法包括磷酸钙沉淀、显微注射和脂质转染。在其他方法中，使用选择性方案来扩增引入的核酸构建体。在这些方法中，细胞用编码可扩增选择性标记物的基因和编码异源蛋白的基因共转染(参见例如Schroder和Friedl,Biotech.Bioeng.53(6):547-59(1997))。选择初始转化体后，通过逐渐增加培养基中的选择剂(例如二氢叶酸还原酶)来被扩增转染的基因。在某些情况下，通过这些程序可将外源基因扩增数百倍。在哺乳动物细胞中表达重组蛋白的其他方法利用使用附加型载体(例如质粒)的转染。

目前制备用于表达重组蛋白的哺乳动物细胞系的方法存在几个缺点。这些问题包括细胞毒性、不能递送较大的基因或遗传构建体、批次间表达水平的显著不一致、不稳定的表达、和所表达蛋白质的不适当定位、翻译后修饰和/或折叠。因此，本领域需要制备表达重组蛋白的宿主细胞的改良方法。

发明内容

本公开涉及用于产生蛋白质的方法和组合物。具体而言，本公开涉及在哺乳动物细胞中产生重组蛋白(例如，药物代谢酶和药物转运体囊泡、微粒体或细胞级分)中的电穿孔介导的基因递送。

例如，在一些实施方式中，本公开提供了产生膜结合蛋白的方法，所述膜结合蛋白包括囊泡或微粒体中的那些。在一些实施方式中，该方法包括：a)使哺乳动物细胞(例如HEK293，CHO，Hela，S2，MDCK-1，MDCK-II，LLC-PK1，Caco-2，Huh7和V79细胞)与编码膜结合蛋白(例如转运蛋白(例如ABCB1，ABCB4，ABCB11，ABCC1，ABCC2，ABCC3，ABCC4，ABCC5，ABCC6，ABCG2或其同源物)的核酸接触；b)电穿孔该哺乳动物细胞使得所述核酸进入所述哺乳动物细胞；和c)分离包含感兴趣的膜结合蛋白的细胞膜。

在一些实施方式中，哺乳细胞是人细胞。在一些实施方式中，细胞是非人灵长类动物细胞，大鼠细胞，小鼠细胞，仓鼠细胞，狗细胞或猪细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是杂交瘤。

在一些实施方式中，该方法还包括在电穿孔步骤后培养细胞的步骤(例如，在丁酸钠存在下)。在一些实施方式中，分离步骤包括均质化。在一些实施方式中，感兴趣的膜结合蛋白包含与天然膜结合蛋白相似的翻译后修饰。在一些实施方式中，该方法还包括使膜结合蛋白与测试化合物(例如药物)接触的步骤。

进一步的实施方式提供了通过任何上述方法产生的分离的囊泡或微粒体。