[发明专利]将原始生殖细胞分化为功能上成熟的卵母细胞的培养方法

说明书

本发明的课题是提供一种通过体外培养将原始生殖细胞分化为功能GV期卵母细胞的方法。本发明涉及一种通过体外培养将原始生殖细胞分化为功能GV期卵母细胞的方法，其包括：(a)通过在消除雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子的影响的条件下，培养原始生殖细胞和邻近原始生殖细胞的支持细胞来产生次级卵泡的步骤；(b)部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的步骤，其中卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层构成产生的次级卵泡；和(c)通过在含有高分子化合物的培养基中培养构成次级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层，使卵母细胞分化为功能GV期卵母细胞的步骤。

技术领域

本发明涉及用于将原始生殖细胞分化成功能上成熟的卵母细胞的培养方法。

背景技术

只有生殖细胞能够将遗传信息传递给下一代。而且，生殖细胞中的卵子起着启动发育并引导早期发育的作用，因此，卵子负责了非常重要的主要作用。体细胞分裂阶段的大量原始生殖细胞存在于雌性哺乳动物的胚胎性腺中。出生前，他们都转向减数分裂并分化成卵母细胞。转移到减数分裂后，卵母细胞不能再次增殖，并且卵巢中的卵母细胞处于停滞的发育阶段。根据动物物种独特的发情周期和排卵次数，只有一部分卵母细胞可以生长并成熟。因此，雌性在其一生中产生的可育卵子的数量与原始生殖细胞的数量及作为雄性生殖细胞的精子相比非常小(参见非专利文献1和2)。此外，分化成功能卵子的详细机制尚未阐明。鉴于上述情况，建立将原始生殖细胞分化成卵子的体外培养方法可以成为克服卵子发生过程中的上述问题的一种方法。此外，这种体外培养体系的建立确保了卵子的新来源。然而，目前还没有关于减数分裂前的雌性原始生殖细胞和卵泡生成前的未成熟的卵母细胞能够通过体外培养成功分化成功能卵子(即能够产生后代的卵子)的报道。这是由于在培养条件下还没有重现用于足够支持卵子分化的卵泡的形成及卵母细胞的生成和成熟。

已经提出了一些用于从原始生殖细胞产生全功能卵子的体外培养体系，但是即使通过这些方法，由于卵泡形成异常和卵母细胞生长不足，因此尚未达到下一代发育。

例如，非专利文献3公开了一种通过在激活素A的存在下培养胎龄12.5天(12.5days post coitum(dpc))的雌性小鼠性腺的一部分，然后与颗粒膜细胞(preantralgranulosa cells：PAGC)共培养，提高分化成第二次减数分裂中期卵子的效率的方法。但是，没有关于通过非专利文献3的方法获得的卵子可以发育到下一代的报道。

在小鼠中，还有报道称，将12.5-dpc胚胎性腺移植到成年雌性小鼠中，并且在移植后14天取得的次级卵泡通过体外培养分化成能够产生后代的功能卵子(参见非专利文献4)。最近，通过体外培养从ES细胞和iPS细胞产生原始生殖细胞样细胞。也如所报道的，将这些细胞与12.5-dpc的性腺体细胞共培养后，将该细胞凝结块移植到小鼠体内，以分化成能够产生后代的功能卵母细胞(参见非专利文献5)。然而，在非专利文献4和5中，需要将靶细胞移植到小鼠体内以实现减数分裂和卵泡形成并获得成熟的卵母细胞。这意味着，将小鼠个体用于卵母细胞生长，并且卵母细胞没有通过体外培养完全成熟。

非专利文献1公开了一种卵母细胞培养方法，其包括在高分子化合物存在下培养卵母细胞和其外周体细胞的复合体的步骤。非专利文献1中的方法能够有效地使从成体卵巢分离的卵母细胞在体外成熟。然而，非专利文献1的方法是：通过从活体内的发育中的卵泡收集卵母细胞-颗粒细胞复合体，获得在第一次减数分裂中的前期停滞的卵母细胞；使该卵母细胞进行体外生长和体外成熟。该方法不是用原始生殖细胞开始体外培养的方法。

因此，目前还没有关于使原始生殖细胞或原始生殖细胞样细胞通过体外培养而成功形成功能卵子而不使用活体的方法的报道。如果能够使哺乳动物原始生殖细胞在减数分裂前通过体外培养发育为功能卵子，则能够确保大量的卵子。该方法对于将复杂的卵子形成机制可视化和理解该机制也是有帮助的。因此，通过体外培养从原始生殖细胞产生功能卵子的方法是所期望的。

[现有技术]

[专利文献]