[发明专利]包含部分的融合蛋白质晶体

说明书

一种蛋白质晶体，包括在晶格中具有可用空间的第一蛋白质晶体，其中第二蛋白质晶体和部分可容纳在该晶格中的可用空间中。第一蛋白质和第二蛋白质由一种或多种核酸构建体共表达。在优选实施方式中，第一蛋白质是p21‑激活激酶PAK4，第二蛋白质是PAK4激酶抑制剂Inka1，并且部分包括报道分子诸如荧光蛋白质或标记并且融合至iBox或iBox‑C或Inka1。优选地，该晶体是在分离的活细胞中形成的。还提供一种融合蛋白质，包括第一蛋白质和第二蛋白质，其中在结晶时，第二蛋白质与部分一起在第一蛋白质的晶格中的可用空间范围内。还公开了产生该蛋白质晶体的方法。

本发明涉及分离的活细胞中(in cellulo)衍生的结构。特别地，本发明涉及PAK4在与其抑制剂Inka1的复合物中的分离的活细胞中衍生的蛋白质结构。本发明还公开了结构蛋白质晶体学方法和在其中有用的构建体。

蛋白质参与许多生物过程。高分辨率的结构数据允许对许多蛋白质的功能的有用洞察。尽管取得了这些成功，但与可溶性蛋白质相比，已解析的蛋白质结构的数量仍然非常少。结晶是获得蛋白质三维结构所必需的；它往往代表着确定结构的瓶颈。因此，需要开发一种平台以利用蛋白质快速生成晶体，否则这些蛋白质可能难以(在细菌或昆虫细胞中)表达和/或在体外结晶。

这里，我们描述了在与Inka1(激酶的内源性抑制剂)的复合物中人类PAK4的结构。使用含有长50μm晶体的单个哺乳动物细胞，我们在分辨率下确定了分离的活细胞中晶体结构，其揭示了PAK4催化结构域(cat)如何结合细胞ATP和Inka1抑制剂的细节。晶格仅由PAK4-PAK4接触组成，其形成了具有沿晶体长度延伸直径为的通道的六边形阵列。我们已经证明，当与含有抑制序列的Inka1的全长或片段融合时，晶体容纳多种其他蛋白质。当蛋白质表达为单个多肽链时，或者当各种Inka1蛋白质片段与PAK4cat分开表达时，可以形成这些晶体。Inka1-GFP用于监测活细胞中的晶体形成过程。Inka1的类似衍生物将使我们研究细胞和模型生物体中PAK4抑制的作用，从而能够更好地验证靶向PAK4的治疗剂。

哺乳动物PAK同种型根据其结构和生化特征分类为两组：在人类中常规的或Ⅰ组的PAK包括PAK1-3，而Ⅱ组的PAK(PAK4-6)由哺乳动物中的三种基因编码。PAK4样的激酶无所不在地表达在后生动物中，但在原生动物或真菌中没有被发现。这与主要在哺乳动物细胞中的细胞-细胞接触处起作用的PAK4是一致的，与也是粘附连接形成所需要的Cdc42是一致的。PAK4基因缺失小鼠的胚胎致死性表型涉及在胎儿心脏中以及在神经元发育和轴突生长中的缺陷⁸。PAK4的丢失阻止了适当的极化，从而阻止了内皮腔的形成⁹，与PAK4-/-小鼠中所见的缺陷一致。

PAK4是一种与细胞转化和癌症转移有着强联系的激酶。最近已经阐明了PAK4偏好含有底物位点的丝氨酸的结构基础。我们已经示出Cdc42通过以类似于假底物的方式结合的自抑制结构域(AID)在哺乳动物细胞中直接调节PAK4活性^1,2。这与缺失Cdc42/Rac相互作用结合(CRIB)结构域中的残基10-30的PAK4是活性的观点是一致的。虽然PAK1体内激活通过激活环Thr-423磷酸化发生，但值得注意的是PAK4在Ser-474上是组成性地磷酸化的¹，并通过AID的分子内缔合被抑制。Cdc42的结合可用于激活细胞中的PAK4，但尚不清楚是否存在与此激活相关的任何自动磷酸化事件¹。由于PAK4没有显示出利用接头，所以我们研究了在青蛙中首次被鉴定为PAK4结合蛋白质的Inka1可以发挥这一作用的可能性。

体内蛋白质结晶在哺乳动物实例中很少见，包括胰岛素和夏科-莱登晶体(Charcot-Leyden crystal)。观察到血红蛋白在稀释未纯化的红细胞裂解物时可以结晶，促进了蛋白质X射线晶体学的出现。直到最近细菌或昆虫细胞内生成的微晶才变得适于X射线分析^3-5。在哺乳动物细胞中形成衍射质量微米级晶体的珊瑚荧光蛋白质⁶表明哺乳动物细胞环境可能是许多蛋白质的合适宿主，这些蛋白质通常不是晶体。