[发明专利]用于对试样的以荧光记号标记的结构高分辨率成像的方法和设备

说明书

为了对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像，以光强度分布加载所述试样，在所述光强度分布中，聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值与聚焦的荧光阻抑光(19)的由一些强度极大值包围的强度极小值叠加成光强度分布(22)。在此，以所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值选择性地扫描所述试样的感兴趣的部分区域，其中，记录从所述试样发射的荧光(15)以及将其与所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值在所述试样中的相应的位置相对应。对于所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值的相应的位置，当已记录从所述试样发射的荧光(15)的预给定的最大光量时，和/或，当在预给定的时间段之内还未记录从所述试样发射的荧光(15)的预给定的最小光量时，至少中断所述试样的以所述光强度分布(22)的聚焦的荧光阻抑光(19)的加载。选择所述试样的感兴趣的部分区域，其方式是，使聚焦的荧光激发光在无荧光阻抑光(19)的情况下对准所述试样，其中，记录从所述试样发射的荧光(15)，其中，如果对于所述试样的一部分区域在预给定的测试时间段(Δt1)之内已记录从所述试样发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM1)，则将所述试样的所述部分区域定义为感兴趣的部分区域。

技术领域

本发明涉及一种用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的方法，其中，以包括聚焦的荧光激发光的强度极大值的光强度分布加载试样，其中，以光强度分布扫描试样的感兴趣的部分区域，其中，记录从试样发射的荧光并且将其与光强度分布的相应的位置相对应。此外，本发明涉及一种用于执行该方法的设备。

本发明尤其涉及一种这样的用于高分辨率成像的方法，其中，用于扫描试样的感兴趣的部分区域的光强度分布除了具有聚焦的荧光激发光的强度极大值之外，具有与之叠加的、聚焦的荧光阻抑光的由一些强度极大值包围的强度极小值，从而借助于荧光阻抑光缩小试样的以下体积：所记录的荧光可以来自于该体积。尤其可以以此方式通过在激发光的波长下的所谓的衍射边界减小该体积的尺寸并且因此减小空间分辨率。荧光阻抑光可以以不同的方式阻抑用于标记试样的感兴趣的结构的荧光记号的荧光，尤其通过在STED荧光显微镜中的受激发射或者通过将荧光记号转到无荧光能力的暗状态——如例如在具有可控的荧光体的RESOLFT荧光显微镜的情况下——来阻抑。

但在一些实施方式中，本发明也涉及用于对试样的结构进行高分辨率成像的方法，其中，不使用荧光阻抑光，也即例如共焦的激光扫描荧光显微镜。

在所有根据本发明的方法中，由于试样的以光强度分布的加载而存在以下危险：通过光强度分布的影响来改变试样。试样的明显的改变可以在于：使用于标记待成像的结构的荧光记号漂白，即持续地使其失活。但是，荧光记号的漂白所基于的光化学过程也对试样的其他的组成部分产生影响。尤其是活着的生物试样可能由于光强度分布的影响而受损害或者完全被杀死。

由于光强度分布的影响而改变试样的危险随着在光强度分布中的光强度和用于加载试样的光剂量而提高。在使用借助以激发光激发的荧光记号的受激发射起作用的荧光阻抑光的情况下，在光强度分布中的光强度必然特别高。相应地，对试样的所不期望的影响的危险也特别高。相反，STED荧光显微镜适合于，使在试样中的以荧光记号标记的结构在非常短的时间内成像，这对于变化的试样、如尤其活着的生物试样是特别感兴趣的。

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