[发明专利]产生包含种系遗传修饰的动物的方法

说明书

本发明涉及用于产生包含靶向种系遗传修饰的非人类动物例如禽类的方法，其包含靶向种系遗传修饰，其中核酸酶(可是CRISPR、ZFN或TALEN)在卵母细胞受精之前递送至精子。

技术领域

本发明涉及用于产生包含靶向种系遗传修饰的非人动物(例如禽类)的方法。

背景技术

制造转基因动物的总体目标是将遗传修饰稳定引入宿主动物的种系，并可以以孟德尔方式传递给后代。通过掺入遗传修饰，可以特异性改变动物的特征。转基因动物因多种目的而产生。它们可以用作基础研究模型、专门的非农业目的(如药品生产或异种移植)，也可以用于增强动物生产性状和产品。因此，对开发提高动物(特别是家畜动物包括鸟类)转基因过程的效率和特异性的方法很有兴趣。

转基因和基因敲除禽类物种通过增加对人畜共患疾病的抵抗力、减少家禽产品的过敏原潜力和产生新的生物医学模型，在家禽业和医学界具有巨大潜力。使用目前的培养然后将生殖细胞转移到胚胎中，或将循环生殖细胞直接注射到胚胎中以建立转基因鸟类的繁殖群的方法，需要两代以及孵化和筛选数百只鸟。这是费时的且需要相当多的资源，并且对于许多禽类物种，没有长期培养生殖细胞的方法。寻找在一代中建立繁殖群的方法将节省时间和金钱，并大大减少使用鸟类的数量。

目前产生转基因鸡的方法需要两代，因为在第一代只有一小部分最终成为精子和蛋的生殖细胞或繁殖细胞(reproductive cell)含有期望的转基因或敲除。这意味着当你繁殖这些动物时，下一代只有一小部分会具有期望的性状。这就是为什么必须孵化并筛选数百只雏鸟以获得足够的转基因鸟来建立繁殖群。开发在第一代产生种系转基因或基因编辑的鸟的方法将节省大量时间和资源。

先前的研究已经将精子与期望的转基因DNA和膜结合剂混合，并用DNA和精子混合物对鸟类进行授精。这种方法被称为精子介导的基因转移(SMGT)，并且在多种物种(包括小鼠、绵羊、牛、猪、马和鸡)中取得了不同的成功(Lavitrano et al.,1989；Shemesh et al.,2000；Ball et al.,2008；García-Vázquez et al.,2009；Collares et al.,2011；Pereyra-Bonnet et al.,2011)。SMGT依靠通过非同源末端连接(NHEJ)双链DNA断裂修复途径，随机整合DNA。这效率很低，因为即使发生随机整合，也不保证发生在有利于基因表达的基因组区域，并且第一代需要数百只鸟来产生转基因繁殖群。

需要开发用于产生包含遗传修饰的动物的改进方法，特别是允许在基因组中的预定位置进行靶向遗传修饰的方法。

发明概述

本发明人已经开发了用于在非人类动物的基因组的预定位置处引入种系遗传修饰的方法。该方法可用于产生在动物的每个细胞中都具有靶向遗传修饰的非人类动物。

在第一方面，本发明提供了用于产生包含靶向种系遗传修饰的非人类动物的方法，所述方法包括：

(i)向精子递送可编程核酸酶，

(ii)用所述精子使卵子受精，和

(iii)从所述受精卵产生动物，

其中所述核酸酶将遗传修饰引入精子和/或卵子的DNA中。

在一个实施方案中，该方法进一步包括，筛选得自步骤(iii)的动物的种系遗传修饰。在一个实施方案中，筛选是对动物的包含DNA或RNA的样品(例如种系细胞)进行PCR和/或测序。在一个实施方案中，筛选确定动物是否对于遗传修饰是纯合的或杂合的。

在一个实施方案中，将可编程核酸酶在包含转染剂的组合物中递送至精子。在一个替代实施方案中，使用电穿孔将可编程核酸酶递送至精子。