[发明专利]使用基于核酸引导的核酸酶的系统捕获核酸

说明书

本文中提供了用于例如通过使用基于核酸引导的核酸酶的系统捕获核酸的方法和组合物。

对相关申请的交叉援引

本申请要求于2015年8月19日提交的美国临时申请序列号62/207,359的优先权，将其通过提述完整并入本文。

发明背景

基因组特定区域的靶向测序仍然是研究人员感兴趣的，特别是在临床环境中。遗传疾病、癌症的临床诊断和许多研究项目依赖于靶向测序，以实现靶定位点的高覆盖率测序，同时降低测序成本。目前，用于这个目的的主要方法是1)基于杂交的富集，和2)多重PCR。在前一种方法中，使用生物素标记的短寡核苷酸探针从文库中“拉出”感兴趣的序列。这个过程既费时又昂贵，而且需要许多实践步骤。此外，一些“脱靶”序列常常可能保留在所得产品中。基于多重PCR的方法可以更快，但是靶标数可能有限并且成本可能很高。需要的是有效捕获感兴趣的核酸区域的方法，其简单、特异、快速且便宜。本文中提供了解决这种需要的方法和组合物。

将本文中引用的所有专利、专利申请、出版物、文件、网络链接和文章通过提述完整并入本文。

发明概述

本文中提供了允许选择性捕获感兴趣的核酸序列的方法和组合物。所述核酸可以含有DNA或RNA。本文中提供的方法和组合物对于处理复杂的核酸样品特别有用。

在一个方面，本发明提供了捕获靶核酸序列的方法，其包括：(a)提供包含多个衔接子连接的核酸的样品，其中所述核酸在一端与第一衔接子连接并在另一端与第二衔接子连接；(b)使所述样品与多个核酸引导的核酸酶-gNA复合物接触，其中所述gNA与在所述核酸的子集中包含的感兴趣的靶定位点互补，由此产生多个在一端与第一或第二衔接子连接并且在另一端无衔接子的核酸片段；和(c)使所述多个核酸片段与第三衔接子接触，由此产生多个在一端与第一或第二衔接子连接并且在另一端与第三衔接子连接的核酸片段。在一个实施方案中，所述核酸引导的核酸酶是CRISPR/Cas系统蛋白。在一个实施方案中，所述核酸引导的核酸酶是非CRISPR/Cas系统蛋白。在一个实施方案中，所述核酸引导的核酸酶选自以下各项的组：CAS I类I型、CAS I类III型、CAS I类IV型、CAS II类II型和CAS II类V型。在一个实施方案中，核酸引导的核酸酶选自以下各项的组：Cas9、Cpf1、Cas3、Cas8a-c、Cas10、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Csm2、Cm5、Csf1、C2c2和NgAgo。在一个实施方案中，所述gNA是gRNA。在一个实施方案中，所述gNA是gDNA。在一个实施方案中，与多个核酸引导的核酸酶-gNA复合物接触而切割在所述核酸的子集中包含的感兴趣的靶定位点，由此产生多个在一端包含第一或第二衔接子并且在另一端没有衔接子的核酸片段。在一个实施方案中，所述方法进一步包括使用第一或第二和第三衔接子特异性PCR扩增步骤(c)的产物。在一个实施方案中，所述核酸选自以下各项的组：单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA和DNA/RNA杂合物。在一个实施方案中，所述核酸是双链DNA。在一个实施方案中，所述核酸来自基因组DNA。在一个实施方案中，所述基因组DNA是人的。在一个实施方案中，所述在末端连接衔接子的核酸的长度为20bp至5000bp。在一个实施方案中，感兴趣的靶定位点是单核苷酸多态性(SNP)、短串联重复(STR)、癌基因、插入物、删除、结构变异、外显子、基因突变或调控区。在一个实施方案中，扩增产物用于克隆、测序或基因分型。在一个实施方案中，衔接子的长度为20bp至100bp。在一个实施方案中，衔接子包括引物结合位点。在一个实施方案中，衔接子包括测序衔接子或限制性位点。在一个实施方案中，感兴趣的靶定位点代表少于50％的样品中的总核酸。在一个实施方案中，所述样品获自生物样品、临床样品、法医样品或环境样品。在一个实施方案中，第一和第二衔接子是相同的。在一个实施方案中，第一和第二衔接子是不同的。在一个实施方案中，所述样品包括测序文库。