[发明专利]用于催化性测定的方法和组合物

说明书

提供了用于使用催化性DNA(例如，其可以核酸序列为底物)进行测定的方法和组合物。

本申请要求2015年7月17日提交的美国临时申请号62/193,649的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

1.技术领域

本发明一般涉及分子生物学领域。更具体地，涉及核酸的检测和定量。

2.相关技术

聚合酶链式反应(PCR)是医学和生物学研究实验室中常用的分子生物学技术，用于多种任务，例如遗传疾病的检测、遗传指纹的鉴定、传染病的诊断、基因的克隆、亲子鉴定和DNA计算。由于其无与伦比的扩增和精确能力，PCR已被分子生物学家接受为用于核酸检测的首选方法。DNA检测通常在PCR反应的终点或平台期进行，使得难以量化起始模板。实时PCR或动态PCR(kinetic PCR)通过记录随着反应进程的扩增子浓度改进了终点PCR分析的能力。扩增子浓度最经常通过与经扩增靶标相关的荧光信号变化来记录。实时PCR优于终点检测的方面还在于，由于其可以在封闭系统中进行，所以污染有限。其他优点包括更高的灵敏度、动态范围、速度以及需要更少操作。

最近，采用催化性核酸(catalytic nucleic acid)的检测化学已用于实时PCR。催化性核酸能够采用赋予可切割底物核酸序列的酶或催化活性的结构构型。然而，使用催化性核酸进行多重PCR(multiplex PCR)的能力受限于热循环仪中可用的荧光检测通道的数目。例如，设计来检测4种靶序列的多重反应要求仪器能够通过光谱差异区分不包括对照的4种不同的自由浮动的荧光染料。这些要求不仅限制了实际的复用能力，而且还增加了成本，因为这样的仪器通常需要多个激光器和滤波器。本发明的多个实施方案克服了利用催化性核酸的测定的有限的复用能力。

发明内容

一个实施方案提供了一种包括以下的方法：(a)使第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与促进剂核酸和底物核酸杂交以形成催化活性核酸酶；(b)用所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段；(c)使所述底物核酸的5’片段与捕获探针杂交，其中所述捕获探针包含与所述底物核酸的5’-片段互补的第一区域，提供与所述底物核酸的5’-片段的3’-末端核苷酸之错配的第二区域，以及提供用于从所述底物核酸的5’-片段的3’-端进行核酸合成的模板序列的第三区域；(d)从所述底物核酸的5’-片段移除3’-末端核苷酸以形成所述底物核酸的可延伸5’-片段；以及(e)沿着所述捕获探针延伸所述底物核酸的可延伸5’-片段。在一些实施方案中，所述方法还包括对双链延伸产物进行解链分析(melt analysis)，所述双链延伸产物是通过沿着所述捕获探针延伸底物核酸的可延伸5’-片段形成的。

一个实施方案提供了一种包括以下的方法：(a)使第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与促进剂核酸和底物核酸杂交以形成催化活性核酸酶；(b)用所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段；(c)使所述底物核酸的5’片段与捕获探针杂交，其中所述捕获探针包含与所述底物核酸的5’-片段互补的第一区域，以及提供用于从所述底物核酸的5’-片段的3’-端进行核酸合成的模板序列的第二区域；以及(d)沿着所述捕获探针延伸所述底物核酸的5’-片段。在底物核酸的切割不在3’端留下可延伸核苷酸的一些实施方案中，所述方法还可包括从所述底物核酸的5’-片段移除3’-末端核苷酸以形成所述底物核酸的可延伸5’-片段。在一些实施方案中，所述方法还包括对双链延伸产物进行解链分析，所述双链延伸产物是通过沿着所述捕获探针延伸底物核酸的可延伸5’-片段形成的。