[发明专利]2型人副流感病毒载体和疫苗

说明书

本说明书包含日本专利申请号2015-119097(2015年6月12日提交)和日本专利申请号2016-63315(2016年3月28日提交)的说明书中描述的内容，本申请的优先权是基于这些申请。

技术领域

本发明涉及非传播性2型人副流感病毒载体和利用该载体制备的疫苗。

背景技术

为了制备高效的中和抗体诱导重组疫苗，适合的是使用具有膜融合活性的包膜蛋白(RSV F、埃博拉GP等)的全长作为疫苗抗原。然而，已经报道：该蛋白在与靶细胞或类似物融合前和融合后改变了其三维结构；具有与细胞融合之前的结构的、融合前蛋白诱导有效的中和抗体；该蛋白在融合前(prefusion)状态下具有不稳定结构；并且，使处于融合前状态的蛋白结构稳定并将其用作疫苗抗原的尝试已经进行(非专利文献1至4)。

RS病毒(RSV)是具有包膜的病毒，分类为副粘病毒科的肺病毒属，并具有直径为80至350nm的球状或细丝形状，并且它具有主要亚型A和B，且引起呼吸感染。RSV的初次感染展现不同症状，包括诸如流感样症状的温和症状到诸如严重的细支气管炎或肺炎等下呼吸道疾病。虽然存在针对RSV的母传抗体，但是它们逐渐减少并在出生后七个月检测不到。初次感染明显，并且发展成下呼吸道疾病的风险高，出生后六个月内感染为最严重。一项流行病学研究(2009年)表明，5岁以下的婴儿住院人数在美国每年为7.5万至12.5万，在欧洲五国为8万，在日本为3万至8万；65岁的老年住院人数在美国为20万，在欧洲五国为20万，在日本为14万。

现在不存在控制RSV感染的有效疫苗，并且仅存在基于抗RSV人源化单克隆抗体的帕利珠单抗(Synagis)的对症治疗法。在RSV开始流行之前到流行期间通过每个月一次的15mg/kg的剂量肌内注射，从而期待帕利珠单抗的预防效果。然而，人源化单克隆抗体相当昂贵，并且日本的保险覆盖对象限于早产儿、有慢性肺病的儿童和唐氏综合征儿童。抗体的高成本使得难以扩大意欲给药的患者。

因此，亟需开发用于控制RSV感染的廉价疫苗。然而，以下所述的过去的疫苗灾难造成了与用于其他感染性疾病的疫苗相比在开发疫苗方面的显著延迟。

在1965年至1966年间，将以与流感或脊髓灰质炎疫苗相同的方式用福尔马林处理RSV而制备的灭活疫苗(命名为批次100)与铝佐剂一起用于临床试验，对没有RSV感染史的婴儿进行了接种。疫苗接种后的RSV自然感染造成了不幸的结果，其中疫苗接种组的入院率是非接种组的16倍(疫苗接种组中的80％婴儿入院)，并且两人死亡(RSV感染重症化ERD：enhanced respiratory disease)。从那以后，进行了深入调查来确定ERD的原因。

在由普通RSV引起的细支气管炎中未观察到嗜酸性粒细胞或嗜中性粒细胞浸润到肺中。然而，在接种福尔马林灭活的RSV疫苗(批次100)后由RSV自然感染引起的婴儿死亡中，观察到了嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞等明显浸润到肺中，并且由于IL-4/IL-5细胞因子的产生的增加而过度诱导2型T辅助细胞(Th-2)。当时，据报道，观察到了针对RSV的抗体滴度增加，但是对针对RSV具有高中和活性滴度的抗体的诱导较低。据报道，RSV的膜蛋白之一的F蛋白作为疫苗抗原是重要的，但也应理解，F蛋白依赖于环境改变其三维构象。据动物试验报道，福尔马林处理不仅改变RSV F的三维结构，而且还大大增加蛋白中的羰基含量并且诱导Th2反应；结果很有可能导致ERD(非专利文献5)。此文献描述了与福尔马林处理的RSV疫苗相比，热处理的RSV(仅三维结构被改变)疫苗导致较低的嗜中性粒细胞向肺组织的浸润，并且认为福尔马林处理的RSV疫苗的ERD诱导不仅仅由于抗原的三维结构的改变。

对于中和RSV的抗体诱导，作为RSV的膜蛋白的F蛋白作为抗原是重要的。F蛋白被翻译为F0或蛋白前体。F0具有存在于其中的两个弗林蛋白酶切割位点，并且通过成熟过程，它被切割成F1和F2，F1和F2通过S-S键交联(成熟的F蛋白)。弗林蛋白酶切割使得被称为p27的27个多肽缺失。已知成熟的F蛋白在感染的细胞和病毒包膜上形成三聚体，并且根据环境不同而采用两种不同的三维结构即融合前F(prefusion F)和融合后F(postfusion F)。F蛋白在RSV-细胞融合前通常采用融合前F结构，但是这种结构是热力学不稳定的，并且容易通过细胞融合、加热、变性剂、负责将F蛋白锚定到细胞和包膜上的跨膜序列的缺失而变为热力学稳定的融合后F结构。通过X射线晶体学分析发现了融合前F和融合后F的三维结构，并且已经详细报道了它们各自结合的抗体及它们的结合位点(非专利文献1)。