[发明专利]细胞中代谢物的生产和检测

说明书

相关申请数据

本申请要求于2015年4月13日提交的美国临时申请62/146,478号的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。

政府权益的声明

本发明在美国能源部授予的DE-FG02-02ER63445的政府支持下完成。政府对本发明拥有一定的权利。

技术领域

本发明一般涉及遗传修饰的细菌和检测遗传修饰的细菌中代谢物生产的方法。

背景技术

小分子诱导型系统是遗传编码的生物传感器，其响应于小分子诱导剂的存在而调节基因表达。最广泛使用的生物传感器之一是变构DNA结合蛋白LacI，其通过在转录起始位点附近结合并抑制转录起始天然地调节大肠杆菌中的乳糖分解代谢操纵子。当诱导分子如异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)存在于细胞中时，它与LacI蛋白结合并且LacI-IPTG复合物与DNA解离，允许转录进行。工程改造的LacI诱导系统的构建和表征导致广泛用于从蛋白质过表达到信号处理甚至染色体可视化的应用。

由于其普遍适用性和广泛表征，一小组规范的诱导型调节物(LacI，TetR，AraC，LuxR)被重复用于多种应用。其他充分表征的诱导型系统是可用的(PrpR，RhaRS，CymR，XylS)，但是除了CymR以外，它们受困于代谢物抑制和/或弱诱导。其他表达控制范例包括提供配体介导的翻译控制的核糖开关和光调控的光遗传系统，这是对化学诱导的补充。

发明内容

本公开的实施方式涉及鉴定对于从细菌菌株群产生代谢物优化的细菌菌株的方法。本文所述的方法可用于从数百万个效力较低的菌株中快速鉴定出用于化学生产的最佳菌株。本文描述的实施方式旨在适用于广泛范围的化学物质，所述化学物质可由具有经遗传修饰以包含所需化学物质的合成途径的基因组的微生物合成。

根据一个方面，微生物的基因组被经遗传修饰以包括编码代谢物结合分子(在本文中可被称为“传感器”，使得代谢物结合分子结合代谢物并直接或间接“感知”代谢物的存在)的DNA序列，例如合成的或外来的DNA序列。当DNA被包括或插入到微生物的基因组中时，所得到的微生物可以被称为重组微生物。根据一个方面，传感器或代谢物结合分子是变构生物分子，其在结合所需的化学物质或代谢物时经历构象变化，导致基因调节变化。传感器及其相应的结合伴侣是本领域技术人员已知的，并且包括变构分子，如转录因子(其结合DNA以调节结合的DNA序列的表达)，核糖开关，双组分信号传导蛋白和核激素受体。

微生物的基因组也被遗传修饰以包括编码可检测分子或报告物，例如荧光化合物，蛋白质或分子的DNA。表达时，传感器调节微生物中报告物的产生。根据传感器的性质，其可以通过在不存在代谢物的情况下抑制，在存在代谢物的情况下激活，在不存在代谢物的情况下封闭核糖体结合位点等，以及本领域技术人员已知的其他方法来调节报告物的产生。如果在微生物内产生诸如荧光分子的报告物，则可以通过本领域技术人员已知的方法对其进行检测。根据一个方面，荧光水平与所产生的代谢物的量成比例。可以实时检测荧光水平以提供随时间产生的代谢物的量的指示。

根据一个方面，代谢物生产是荧光的函数，其可以实时检测并且随时间监测以确定荧光的增加和减少。因此，可以检测到最佳荧光以允许从减少的产量或不需要量的代谢物的细胞中分离和分选产生所需量的代谢物的细胞。根据一个方面，提供了一种用于确定从群内产生不需要量的代谢物或不产生代谢物的细胞中分离该群内产生所需量的代谢物的细胞的最佳所需时间的方法。然后可以鉴定分离的细胞内的酶和细胞过程并将其用于细胞(即，相同或不同种类的细胞)或无细胞系统如固定化酶反应器中以产生所需量的代谢物。

微生物也已被遗传修饰以包括编码基因的DNA以产生作为传感器的结合伴侣的代谢物。或者，微生物中的内源基因可以产生代谢物。代谢物是需要由微生物产生的目标化学物质。可以是DNA结合分子的传感器在表达时将与代谢物结合。以这种方式，遗传修饰的微生物可以感知其自身的化学物质生产水平，只要传感器能够感知代谢物在微生物内的存在即可。当代谢物由细胞产生时，代谢物以调节报告物基因的方式与传感器结合，结果，微生物产生的报告物与微生物产生的代谢物结合伴侣的量成比例。