[发明专利]半静态细胞培养

说明书

技术领域

本发明涉及诸如柔性细胞袋生物反应器的生物反应器中的细胞培养。更具体地，本发明涉及将自始至终使用单个非静态细胞培养平台来通过初始半静态培养而支持临床量表细胞产物的生成的过程。

背景技术

过继性T细胞治疗是最新的个人化药物，其显示对患者(主要地，肿瘤浸润的T细胞和转基因的T细胞)的治疗价值的标志。已知T细胞治疗具有取决于T细胞产物的类型而变化的独特的培养要求。

已知的关于临床相关的T细胞的扩增的方案要求初期的细胞间接触，其推动T细胞刺激和进一步的增殖。为了促进所要求的细胞间接触的相互作用，细胞悬浮液的最小限度的移动被视为必要，并且，使用放置于保温培养器中的瓶或静态培养袋来实现的静态培养典型地用于该过程阶段。在此背景下，萨默维尔(Somerville)和达德利(Dudley)(2012 OncoImmunology(肿瘤免疫学)；1(8)：1435-1437)指出，诸如Xuri^TM(来自GE Healthcare(通用电气健康护理部门)，先前被称为Wave^TM)生物反应器的非静态生物反应器提出了对过程开发的挑战，过程开发包括该静态步骤，该静态步骤要求细胞依然处于持续的物理接触中。以类似的方式，鲁尼(Rooney)等人(J Immunother(免疫治疗杂志)，2010年；4月：33(3)：305-315)指出，抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对细胞间接触具有严格要求，并且，已证实难以始终适应于移动培养物，因为，在静态培养条件下，功能性细胞的生产最佳。

当T细胞上的T细胞受体(TCR)被抗原呈递细胞(APC)上的抗原-主要组织相容性复合体(MHC)连同第二共刺激信号接合时，使体内的T细胞活化且对其进行诱导以增殖。响应于活化，T细胞经历包括例如细胞大小增大和细胞因子分泌的物理、生物及表型变化。还能够通过使T细胞与共固定化的抗CD28和抗CD3单克隆抗体结合到珠或诸如培养瓶的底部的其他表面上，从而在体外仿效该免疫反应。还通过使T细胞群与表达刺激因子的工程哺乳动物细胞系接触，从而提供了增殖信号。可用于对T细胞进行抗原刺激以实现细胞培养的所有的各种方法的共同点是，需要T细胞与APC或抗体所递送的共刺激信号之间的接近性以及允许在1-5天的持续期内实现该相互作用的条件。

广泛地使用培养瓶和静态培养袋，并且，研究者在进行细胞治疗领域内的过程开发工作时，应用培养瓶和静态培养袋。这些简单的培养皿满足较低的工作容积范围内的要求，这能够应付小的细胞数，且要求标准的实验室设备。静态培养方法支持持续的物理细胞接触，这能够推动T细胞刺激和活化。随着细胞增殖，要求额外的培养皿，并且，皿的数量和细胞悬浮液体积随时间而增大，例如，有可能在30天内从50 ml变成高达≥20 L或更大。这样的工作流程要求高素质人才和时间，并且，由于需要操纵多个皿而繁琐。随着培养皿的数量增加，污染和人为误差的风险也随时间而提高。

当尝试使方案适应于用于监管的依从细胞免疫治疗的生产的更大程度地自动化且从容的过程时，可用于该应用的生物反应器系统的数量有限。若干个临床研究组对诸如摇摆平台的各种生物反应器系统进行了评价。这些系统被认为是支持细胞治疗临床生产过程的标准化和按比例增大(scale up)，并且，能够促进将这些过程实现为第三期临床试验。虽然如此，这些生物反应器中的许多生物反应器不支持初始T细胞刺激步骤中所要求的临界的细胞间相互作用。

当为临床第一/二期研究作准备时，必须使方案工业化且按比例增大，以允许生成足以达到治疗剂量的材料，并且，还允许在优良制造规范(GMP)要求下，处置全部的10-20位患者。此外，为了允许在监管下依从地生成足够的产品材料且为更大得多的群体供给该材料(这将是第三期研究中的情况(数百或数千位患者))，生产过程往往需要强有力的对方案的操纵。

萨德西(Sadeghi)等人(2011 J Immunol Methods(免疫方法杂志)。364：94-100)报告称，能够不在方瓶中进行预先活化和扩增，就直接地在生物反应器系统中启动肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)的迅速扩增。从组织活检切片获得TIL，组织活检切片本身能够充当抗原，使得已经存在抗原。因此，与T细胞悬浮液相比，当以组织活检切片开始细胞培养时，对初始静态阶段的要求不同。然而，萨德西(Sadeghi)等人还注意到，为了成功地启动更高的容积中的TIL的迅速扩增，要求瓶或透气袋中的活化和预先扩增。