[发明专利]用于单分子电子SNP测定的聚合物标记的核苷酸

说明书

本发明提供了具有单分子敏感性的、使用标记的核苷多磷酸类似物并利用纳米孔检测来检测核酸序列中某些位置处的核苷酸的身份或存在的方法，用于这种方法的核苷酸和引物缀合的纳米孔蛋白以及用于产生这种核苷酸和引物缀合的纳米孔蛋白的方法。

本申请要求于2015年3月23日提交的第62/137,014号美国临时申请的权益，其通过引用整体并入本文。

在整个申请中，引用了各种出版物和专利。对于这些参考文献的完整引用可以在说明书的最后找到。这些出版物和专利的公开内容全部通过引用结合到本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的状态。

本申请通过引用包含在名为“160322_0575_87413-A_Sequence_Listing_RBR.txt”的文件中存在的核苷酸和氨基酸序列，其大小为2千字节，于2016年3月21日以IBM-PC机格式创建，具有MS-Windows的操作系统可计算性，该文件作为本申请的一部分包含在2016年3月22日提交的文本文件中。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)是活的生物体的基因组中的单个碱基变异。SNP可发生在基因的编码序列和基因的非编码区域，包括调控区域。基因组编码序列中的SNP分为两类：同义和非同义。由于遗传密码的简并性，同义SNP不改变蛋白序列，而非同义SNP改变所编码的蛋白的氨基酸序列。非同义SNP进一步分为两类：错义和无义。错义突变是产生与野生型相比编码不同氨基酸的密码子的单核苷酸点突变，而无义突变是产生过早终止密码子的点突变。不在蛋白质编码区的SNP可以通过改变剪接序列和转录因子的结合活性以及基因表达来影响基因的功能。在所有的遗传变异中，SNP是人之间最常见的遗传差异。在第二代人类单体型图(Frazer等人，2007)中已经从人类基因组中表征了超过310万个SNP。因此，SNP是研究疾病发生机制的分子基础的重要生物标志物，为精密医学奠定基础。

人类基因组计划和全面的人类基因组序列图谱的构建(Lander等人，2001；Venter等人，2001和Wheeler等人，2008)为研究遗传变异提供了有价值的资源。这些遗传差异包括SNP、基因拷贝数变异、插入和缺失。已经将SNP确立为用于发现和表征疾病基因的独特生物标志物(Kwok 2000和Roses 2000)。这些研究工作需要使用具有高成本效益、高产量和高精度的技术来表征大量的SNP。以下DNA测序平台被广泛用于表征遗传变异：(1)4色荧光Sanger法(Smith等人，1986；Ju等人，1995；Ju等人，1996；Salas-Solano等人，1998和Kheterpal等人，1996)，(2)使用可切割荧光核苷酸可逆终止子合成测序(SBS)(Ju等人，2006和Bentley等人，2008)，(3)在聚合酶反应期间焦磷酸释放之后检测由一系列酶促反应引起的化学发光信号的SBS(焦磷酸测序)(Margulies等人，2005)，(4)在聚合酶反应期间电子检测释放质子的SBS(离子流式测序)(Rothberg等人，2011)和(5)单分子荧光SBS方法(Harris等人，2008，和Eid等人，2009)。然而，这些测序技术并不是为精确检测SNP而设计的，而且对于进行大规模SNP研究而言仍然过于昂贵。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和荧光发射是用于SNP分析的两种主要检测方法。以下回顾使用上述两种检测方法的SNP测定方法。

通过MALDI-TOF MS检测进行的SNP分析

MALDI-TOF MS测量目标分子的质量，以数字格式给出高度准确的结果。通过单碱基延伸(SBE)(Haff等人，1997；Tang等人，1999；Ross等人，1998；Fei等人，1998；和Griffin等人，2000)、杂交(Stoerker等人，2000；和Ross等人，1997)和侵入性切割(Griffin等人，1999和Lyamichev等人，1999)将其用于SNP检测。在通过聚合酶进行单碱基延伸的背景下，MALDI-TOF MS也已被用于基因表达分析和单拷贝DNA单体型分析(Ding et al.,PNAS 100:3059-3064,2003和Ding et al.,PNAS 100:7449-74532003)。