[发明专利]用于单分子电子SNP测定的聚合物标记的核苷酸

权利要求书

1.用于鉴定核酸中一段连续核苷酸残基内的一个位置上的目的单核苷酸残基的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在施加的电压下，将核酸与下列物质一起孵育：

(1)纳米孔，

(2)寡核苷酸引物，其与纳米孔缀合并与核酸中在3’方向上紧邻目的单核苷酸残基的多个核苷酸杂交，

(3)至少一种标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物，

其中所述至少一种NPP类似物具有以下结构：

其中B为选自以下的碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤和它们的类似物，

R和R'各自独立地为H、OH、O-烷基、F、Cl、Br、N₃、NH₂、O-NH₂、O-烯丙基、O-CH₂N₃、2',3'-异丙叉基或仅允许单个核苷酸通过DNA聚合酶掺入的基团，

TAG包括能够被纳米孔检测的任何聚合物分子，以及

(4)核酸聚合酶，

使得如果NPP类似物与目的单核苷酸残基互补，则NPP类似物被掺入引物中，并且连接至被掺入的NPP类似物的标记被拉入纳米孔；以及

b)通过纳米孔检测掺入引物中的NPP类似物的标记的信号，以鉴定掺入的NPP类似物；

从而鉴定目的单核苷酸残基；

其中在步骤(a)中，将所述核酸与一种NPP类似物一起孵育，如果所述NPP类似物未被掺入，则反复地重复与不同NPP类似物的孵育，直至NPP类似物被掺入且其标记被纳米孔检测到。

2.用于鉴定核酸中一段连续核苷酸残基内的一个位置上的目的单核苷酸残基的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在施加的电压下，将核酸与下列物质一起孵育：

(1)纳米孔，

(2)寡核苷酸引物，其与纳米孔缀合并与核酸中在3’方向上紧邻目的单核苷酸残基的多个核苷酸杂交，

(3)至少一种标记的终止核苷多磷酸(NPP)类似物，

其中所述至少一种NPP类似物具有以下结构：

其中B为选自以下的碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤和它们的类似物，

R和R'各自独立地为H、OH、O-烷基、F、Cl、Br、N₃、NH₂、O-NH₂、O-烯丙基、O-CH₂N₃、2',3'-异丙叉基或仅允许单个核苷酸通过DNA聚合酶掺入的基团，

TAG包括能够被纳米孔检测的任何聚合物分子，以及

(4)核酸聚合酶，

使得如果NPP类似物与目的单核苷酸残基互补，则NPP类似物被掺入引物中，并且连接至被掺入的NPP类似物的标记被拉入纳米孔；以及

b)通过纳米孔检测掺入引物中的NPP类似物的标记的信号，以鉴定掺入的NPP类似物；

从而鉴定目的单核苷酸残基；

其中在步骤(a)中，将所述核酸与至少两种NPP类似物一起孵育，所述NPP类似物各自包含不同的碱基或碱基类似物以及不同的标记。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(a)中，将所述核酸与至少四种NPP类似物一起孵育，所述NPP类似物各自包含不同的碱基或碱基类似物以及不同的标记。

4.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(a)中，将所述核酸与正好四种NPP类似物一起孵育，所述NPP类似物各自包含不同的碱基或碱基类似物以及不同的标记。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中每种NPP是脱氧核糖核苷多磷酸(dNPP)。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中每种NPP是双脱氧核糖核苷多磷酸(ddNPP)。

7.根据权利要求6所述的方法，其中每种ddNPP包含具有香豆素-PEG部分的标记。