[发明专利]产生重组蛋白的方法

说明书

本发明涉及在宿主细胞中产生重组蛋白的方法，其包括在细胞培养期间添加聚乙烯亚胺(PEI)。将PEI作为发酵增强剂添加至细胞培养物可导致降低细胞培养物的粘度，和/或增加重组蛋白的细胞外浓度，和/或减少细胞培养至收获点或蛋白回收点的持续时间。

发明背景

重组蛋白的大规模且节约成本的制备、回收和纯化对于生物技术产业是重要的挑战。

大肠杆菌和中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞是用于产生重组蛋白的最广泛使用的生物中的两种。在生产期间的考量包括宿主细胞生长和重组蛋白的表达、蛋白滴度、蛋白位置(例如，细胞内、细胞外、周质等)，以及从最终位置的选择性回收和纯化重组蛋白。平衡和优化这些不同因素并不简单。

因此，存在对于生产、回收和纯化重组蛋白的改进方法的需要。

发明概述

本发明提供在宿主细胞中产生重组蛋白的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。

还提供释放由宿主细胞培养物表达的重组蛋白的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。

还提供降低表达重组蛋白的细胞培养物的粘度的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。

还提供增加由细胞培养物表达的重组蛋白的细胞外浓度的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。

还提供减少收获表达重组蛋白的细胞培养物的时间长度的方法，其包括在细胞培养期间添加PEI。

还提供药物组合物，其包含使用本文所述的方法获得的重组蛋白。

还提供PEI作为表达重组蛋白的宿主细胞培养物的细胞培养增强剂的用途。

还提供PEI作为细胞培养期间的释放剂以提高由所述细胞表达的细胞外重组蛋白滴度的用途。

附图说明

图1：作为细胞外DNA浓度的函数的大肠杆菌发酵液的流变性质。(○)诱导前0至20h，细胞浓度0至30g dwt/l；(●)诱导后20至65h，细胞浓度30至40g dwt/l。流变数据用于幂律拟合，针对增加和减少剪切两者的30s扫描(sweeps)，τ = kγⁿ，(R²=0.99)，γ=37至1200 s^-1 (在所述扫描之间的剪切应力值中未观察到显著差异)。对于[DNA]>1000mg/ml，一些样品似乎展现高表观屈服应力且不剪切。温度23℃。

图2：通过发酵产生DOM0101 (dAb)和构建关于dAb和DNA释放的同位图(parity plot)。A-细胞干重(DCW)、电容和二氧化碳释放速率(CER)的概况；B-细胞外、细胞内和总dAb的概况；C-释放至细胞外空间的DNA的概况；D-比较dAb和DNA释放至细胞外环境中的同位图。100% DNA释放=0.031*最大细胞DCW。构建：同位线(parity line)(^_____)为来自诱导(0% dAb、17% DNA)的等同dAb和DNA释放的线；DNA释放边界(^{_ _ _})是指上限，培养液的流变蛋白超过该上限，使得离心被视为过度有挑战性的。

图3：细胞培养补充剂EDTA、EDTA-尿素和Tween^TM20对dAb (DOM01010)产生以及dAb和DNA的相对细胞外浓度的影响。A-细胞干重(DCW)的时间概况，B-在1000KHz下的电容的时间概况，C-二氧化碳释放速率(CER)的时间概况，D-DNA释放至细胞外空间的时间概况，E-细胞外dAb浓度的时间概况，F-细胞内dAb浓度的时间概况和G-总dAb浓度的时间概况，和H-比较以下培养物的dAb产物和DNA两者释放至细胞外环境中的同位图：对照培养物、用125mM EDTA以5ml/l/h至最终18mM的[EDTA]处理的培养物、用125mM EDTA 7.5M尿素以5ml/l/h至最终18mM的[EDTA]和1M的[尿素]处理的培养物、和经23h递增(以受控方式进行以避免过度发泡)且最终浓度为20ml/l的Tween^TM20处理的培养物。在35h处理时间处的线表示开始EDTA和EDTA-尿素进料。对于图3H，闭合点为对于在EDTA或EDTA-尿素发酵中实现的最大水平的%细胞外dAb释放；开放点为对于如在对照中获得的最大值的% dAb释放。