[发明专利]改善视觉的基因疗法

说明书

技术领域

本发明涉及基因治疗载体用于改善患者的视觉的用途。

背景技术

在许多哺乳动物物种(包括小鼠和人)中，在暗光下调节视觉的视杆细胞(rod photoreceptor)的数目远超过视锥细胞(cone photoreceptor)的数目(Curcio et al,2000)。然而，在照明使视锥整日运作的工业化世界中，视杆介导的视觉的重要性降低。许多从出生起缺少视杆功能的患者只是偶然被发现，实际上无法识别出他们异常的视觉(Dryja,2000)。相反，当存在视锥功能障碍时，患者总是具有症状，并且通常患有视觉障碍(取决于他们的视锥功能障碍的程度)。然而在一些情况下，仅(或主要是)视锥损失或功能障碍，视杆相对被保留。例如，全色盲是严重的遗传性视网膜营养不良，患者从出生时视锥功能完全丧失，但是可能具有正常的视杆功能(Hess et al,1986；Nishiguchi et al,2005)。多种基因(包括CNGA3(Kohl et al 1998)和PDE6C(Chang et al,2009；Thiadens et al,2009))中的突变与该疾病相关。每一种致病基因编码视锥光转导级联的必需组分，所述视锥光转导级联通过引起感光细胞的超极化而将光转化为电信号。在年龄相关性黄斑变性(AMD)中，视觉损伤主要是由富含视锥的黄斑中央凹的变性引起的。因此，患者丧失中心视觉和敏锐度，但是通常具有相对保存良好的外周斑，因此具有一些有用的受限于缺乏中央凹外部视锥的残余视觉。

视杆对光高度灵敏，这使视杆在昏暗条件下感知少量的光。相反，视锥的灵敏度较低，但是能够在日光中处理大量光并连续传导视觉信号。这种功能差异部分是由于光信号传导的失活机制——由RGS9、R9AP(也称为RGS9BP)和Gβ5组成的GTPase复合物——的效率导致的。RGS9是水解与G蛋白偶联的GTP的催化组分，而R9AP和Gβ5是必需组成型亚基(Burns et al,2009；Burns et al,2010)。重要的是，R9AP将所述复合物连接到光感受器外段(在那里还发生光转导信号传导)处的圆盘膜(Baseler et al,2002)。R9AP的表达决定了GTPase复合物的水平，以使超出R9AP而产生的任何RGS9可能快速被降解(Martyemyanov et al,2009)。鼠视杆中R9AP的过表达足以增加GTPase活性，并且足以大幅加快它们的失活动力学，如单细胞记录所证明的(Krispel et al,2006)。据估计，视锥中RGS9表达比视杆中的RGS9表达高约10倍(Cowan et al,1998；Zhang et al,2003)。这为视锥从曝光中快速恢复并因此保持对连续光刺激的功能性的能力提供了基础。这还使视锥响应于更快速的刺激。实际上，在临床上，具有由RGS9或R9AP中的遗传缺陷引起的光转导级联的延迟失活或具有缓慢的视觉(bradyopsia)的患者具有严重的视锥介导的视觉损伤，包括昼盲症和看见移动物体的能力下降(Nishiguchi et al,2004；Michaelides et al,2010)。同时，视杆介导的视觉受到相同突变的影响较小。

一些黄斑变性病症，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和遗传性黄斑变性病症也表现出视锥功能障碍，但是正常或损伤更少的视杆功能。在发达国家，黄斑变性是失明最主要的原因，并且因为AMD的发病率在生命中每10年就会变为原来的4倍，预期未来AMD病例将随着寿命的增加而增多。用于治疗AMD的药物已经占英国国家卫生服务部的全部药物预算的1％以上。尽管晚期AMD患者可接受训练以将视线移向中央凹外，然而视杆细胞的低更新率和低漂白阈值限制了所产生的视觉质量。

发明内容

使用缺少视锥功能的小鼠，我们证明了AAV介导的Rgs9锚定蛋白(R9AP)——介导光转导级联失活的GTPase复合物的关键组分——的过表达导致视杆驱动的视网膜电图的脱敏和“明视偏移(photopic shift)”。治疗在损失暗视(更低的光水平)功能的情况下使视杆比未经治疗的细胞响应于更亮的光(最高达约2.0log)。使用经治疗的视网膜的多电极阵列测量表明，视网膜神经节细胞通过表现出明视光水平的分级响应，也反映出视杆的“明视偏移”。通过对响应于旋转正旋光栅的头部追踪移动进行定量来测量的对比敏感度函数表明，在室内光条件下敏感度提高最多达25倍，并且更快响应于反复的刺激。此外，在这些小鼠中可漂白的视紫红质水平的生化测量表明，视循环没有限制视杆功能。