[发明专利]微孔电极及分析化学物质的方法

说明书

一种微孔电极，所述微孔电极包括：一个或多个第一电极(301)；与每个第一电极(301)相对设置的第二电极(303)，每个第一电极(301)和与其相对的第二电极(303)之间具有通道(601)，通道(601)的至少一端连通有腔(401)；位于所述腔(401)中的一个或多个引导电极(501)，该微孔电极检测信号灵敏，读长大大提升。还涉及该微孔电极的制造方法、微孔电极阵列、传感器芯片及测序系统，以及基于该微孔电极的分析化学物质和核酸分子的方法。

技术领域

本发明涉及半导体技术领域及化学物质分析领域，尤其涉及一种微孔电极及其制造方法、微孔电极阵列、传感器芯片及测序系统，以及基于该微孔电极、微孔电极阵列、传感器芯片或测序系统的分析化学物质和核酸分子的方法。

背景技术

在过去的十年中，第二代DNA测序技术的不断改进使得千元基因组($1,000Genome)时代离我们越来越近。然而，真正达到千元基因组测序并且推进DNA测序技术用于个体化医疗，还需要取得实质性的进展。以下是第二代测序平台目前面临的四个主要问题：1)由于固有的移相问题导致的读长短；2)由于在碱基并入时需要洗脱步骤导致读速慢；3)扩增时样品准备的工作量大，成本高；4)昂贵的光学系统。而单分子测序技术被认为是最有希望同时解决上述问题的测序方法。

一种新的测序技术是基于纳米孔的测序技术。该技术的基本思想是，当单个DNA分子通过纳米孔时，该纳米孔结构同时作为限制位点和并入位点。牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore Technology，ONT)作为纳米孔测序的领先企业，最近发布了其第一台蛋白纳米孔测序仪，该仪器的读长可以达到一万个碱基，读取速度可以达到100个碱基/秒。与单分子测序的领先公司Pacific Biosciences(PacBio)相比，ONT公司的技术由于不需要光学设备而使得仪器成本和占用空间大大降低了。

虽然大家普遍认为固态纳米孔在稳定性和可扩展性方面更有优势，而稳定性和可扩展性对于一台测序设备的耐用和低成本来说至关重要，但目前基于蛋白纳米孔测序技术的发展更快。与蛋白纳米孔相比，固态纳米孔仍然缺少原子级的准确性和化学的特异性。通过不同的表面修饰技术可以基本达到化学的特异性，但重复生产大的纳米孔阵列在制造工艺上仍然有难度。目前大多数基于纳米孔的测序方法依赖于3-D的纳米级大小的结构，不仅孔的直径足够小，而且孔或者电极的厚度也要与相邻碱基之间的距离一样小。要形成这样的纳米孔，最常用的方法是在氮化硅或石墨烯等薄绝缘材料上用离子束蚀刻或电子束钻孔，但这种方法并非传统方法，并且与标准的半导体制造工艺不相容。这就使得纳米孔制备工艺非常昂贵并且不可重复。但从商业应用上看，基于纳米孔的技术能够提供很长的读长，在读长上优于其它现有的技术，并且能够大大降低测序成本。

有两种方法可以绕开固态纳米孔对准确、有效的制造工艺的要求。一种方法是对DNA样品进行修饰以提高碱基间的信号差别，从而减弱对纳米孔准确性和尺寸的工艺要求。有一些纳米孔测序公司，如Genia Technologies和Stratos Genomics，正在进行这方面的研究。例如，在利用扩增技术的Stratos Genomics测序中，利用专有分子扩增方法，每个碱基都用一个大的、具有强信号的报告分子所替代。Genia Technologies利用DNA聚合酶对模板DNA进行测序，纳米孔可以捕获并识别用酶切割后产生的碱基特异性标签。虽然这些公司目前的研究都集中在蛋白纳米孔，但将这些相同的想法运用到固态纳米孔中应该没有什么技术障碍。另一种方法是将纳米结构从3D减少为2D，因为标准的半导体制造工艺已经能够适用于常规的2D纳米结构，例如纳米线、纳米通道和纳米间隙。当一维的纳米结构不再是个位数时，挑战已经变成如何达到单个碱基的分辨率。目前已有一些方法用于解决这个问题。Nabsys正在研发一种定位测序平台，当DNA模板通过一个纳米通道时(～100nm)，通过检测结合于DNA模板的序列特异性标签，来产生短探针序列的长距离测序图谱。