[发明专利]溶血素方法和组合物

说明书

本文公开用于化脓隐秘杆菌的改进的培养基和培养条件的方法。也公开分离溶血素与化脓隐秘杆菌且纯化溶血素的改进的方法。

技术领域

本发明涉及增加通过化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)，一种牛子宫炎的病原体产生的溶血素的量的方法。本发明另外涉及包含溶血素的组合物，其使用本文所描述的方法分离与纯化，且适用于减轻或预防牛子宫炎。

背景技术

子宫炎为奶牛通过各种微生物病原体的子宫感染的结果。其通常在产后期期间在黄体功能起始之后产生。通常在家畜滞留的环境中发现的细菌大概在产犊期间或之后引入至子宫中。在产生细菌感染的产后母牛中，细菌设法达到子宫，但不立即开始增殖。急性子宫炎在分娩后第0天与第21天之间出现。临床子宫内膜炎(子宫内衬或子宫内膜的发炎或刺激)在分娩后大致第21天与第35天之间出现。超出第35天，子宫内膜炎通常变为亚临床的。

存在多个与天然感染相关的因素，如来自产犊的压力、产奶/泌乳、负能量平衡、免疫抑制和此类动物更易罹患天然感染的事实。造成子宫炎和临床子宫内膜炎的起始的细菌病原体中的一个为化脓隐秘杆菌。此有机体具有多种促进其致病潜力的毒性因子，其中的一个为溶血素，一种胆固醇依赖溶细胞素。此蛋白质为溶血素，且对于免疫细胞，包括巨噬细胞为溶细胞性的。溶血素的表达对于此细菌的毒性是必需的。此蛋白质似乎是到目前为止鉴别的最有前景的候选化脓隐秘杆菌次单位疫苗。至关重要的是经分离溶血素在构象和免疫上与其天然状态的蛋白质类似/相同。因此，从化脓隐秘杆菌产生(且必要时)分离天然溶血素，以及基于其的有效疫苗的方法为高度所需的。

发明内容

公开一种增加通过化脓隐秘杆菌产生的溶血素的产率的方法，其中所述方法包含使用含有葡萄糖以及选自由以下组成的群组的额外浓缩碳源的基础培养基：葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、寡糖、甘油、乳糖、聚葡萄糖、糊精、丁二酸单甲酯和N-乙酰基葡糖胺；在培养基中的葡萄糖耗尽之前添加螯合剂至培养基；收获化脓隐秘杆菌和分离溶血素。

公开一种方法，其中螯合剂为乙二醇四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)或两个的组合。

公开一种用于增加通过化脓隐秘杆菌产生的溶血素的产率的方法，其中化脓隐秘杆菌复制为高于600nm处的5的光学密度(O.D.)的细菌细胞密度。

公开一种增加通过化脓隐秘杆菌产生的溶血素的产率的方法，其中培养基维持在28℃与32℃之间的温度。

公开一种增加通过化脓隐秘杆菌产生的溶血素的产率的方法，其进一步包含使用浓度在10mM与200mM之间的经磷酸盐缓冲的基础培养基。

公开一种增加通过化脓隐秘杆菌产生的溶血素的产率的方法，其进一步包含使用基础培养基，其中培养基的pH在6.0与8.0之间。

公开一种增加通过化脓隐秘杆菌产生的溶血素的产率的方法，其进一步包含使用基础培养基，其中培养基包含血晶素作为铁源。

公开一种增加通过化脓隐秘杆菌产生的溶血素的产率的方法，其进一步包含使用包含聚山梨醇酯80的基础培养基。

公开一种增加通过化脓隐秘杆菌产生的溶血素的产率的方法，其进一步包含使用包含维生素溶液的基础培养基。

公开一种增加通过化脓隐秘杆菌产生的溶血素的产率的方法，其中所述维生素溶液包含以下中的一种或多种：维生素B12；肌醇；尿嘧啶核碱基；烟碱酸；泛酸钙；吡哆醛-HCl；吡哆胺-2HCl；核黄素；硫胺素-HCl；对氨基苯甲酸；生物素；叶酸；烟碱酰胺；和β-NAD。

公开一种增加通过化脓隐秘杆菌产生的溶血素的产率的方法，其中所述维生素溶液仅包含吡哆醛-HCl。

公开一种增加通过化脓隐秘杆菌产生的溶血素的产率的方法，其包含连续、半连续或一次性补充浓缩碳源。