[发明专利]无T‑DNA整合的农杆菌介导的基因组修饰

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年2月2日提交的美国临时申请系列号62/110,735的优先权，其通过引用其全文纳入本文。

技术领域

本发明涉及用于基因组工程改造的方法，包括通过利用修饰的转移DNA(T-DNA)质粒的核酸酶的瞬时表达进行基因组工程改造的方法。

技术背景

革兰氏阴性细菌类的农杆菌(Agrobacterium)利用水平基因转移来造成植物中的肿瘤生成，其通过大肿瘤诱导型(Ti)或根系发生(Ri)质粒将转移DNA(T-DNA)引入植物基因组来进行。为了具有毒力，农杆菌必须包含具有T-DNA和将该T-DNA转移至植物细胞并将其整合进入染色体DNA所需的全部基因的Ti或Ri质粒。尽管Ti和Ri质粒均存在多种变化形式，在天然产生的菌株中常见几种特征：毒力基因、复制起点、冠瘿碱(opine)分解代谢基因、右边界(RB)序列、左边界(LB)序列，和转移DNA(T-DNA)区域。毒力基因和边界序列允许农杆菌通过IV型分泌系统(TIVSS)将所述T-DNA转移进入植物细胞。一旦T-DNA被转化进入植物细胞，其能够在农杆菌毒力蛋白的协助下整合进入宿主基因组。该整合的T-DNA可包含致癌基因和冠瘿碱合成基因，其允许增加冠瘿碱的产量，该物质作为农杆菌的碳源和氮源。Ti和Ri质粒在核苷酸水平上显著不同，而所述质粒可在根癌农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆菌(A.rhizogenes)之间互换，因此使所述细菌具有指示其所包含的Ti或Ri质粒的新病原性特征。农杆菌T-DNA可被修饰并用于二元载体系统，其中，毒力基因和T-DNA在分开的质粒上。该策略已被用于将新基因引入植物基因组(参见例如，Lee和Gelvin，Plant Physiol 146：325-332，2008)。认为Ti或Ri质粒上的毒力基因和许多农杆菌染色体基因是整合机制所必需的。然而，整合机制尚未被完全阐明。

发明内容

本文部分基于如下发现：农杆菌介导的转化可用于植物细胞中序列特异性核酸酶的瞬时表达，以产生非转基因的遗传修饰的植物。例如，农杆菌可用于将编码所需核酸酶基因的T-DNA引入植物细胞，以允许核酸酶在无T-DNA整合的情况下表达。所述核酸酶的瞬时表达可导致定点基因组修饰，使得对所选植物物种的准确工程改造成为可能。这可消除对于后续回交以移除通过传统农杆菌转化整合的外来DNA的需求，减少了调控方面的问题，并加快了推向市场的速度。

本文特别提供一种在植物细胞中瞬时表达多肽的方法。所述方法可包括：将包含T-DNA区域的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒引入植物细胞，所述T-DNA区域包括：(a)T-DNA边界序列，和(b)包含5′启动子区域的多肽编码序列、编码多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而所述多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。例如，所述方法可包括，将抑制整合的T-DNA(iiT-DNA)质粒引入细胞，所述抑制整合的T-DNA(iiT-DNA)质粒对应于Ti、Ri和T-DNA质粒，其已通过移除或失活至少一个T-DNA边界而被修饰的，从而减少所得iiT-DNA的整合。在一些实施方式中，修饰的Ti质粒、Ri质粒或T-DNA质粒的LB被移除或失活，从而破坏了T-DNA向植物基因组中的整合。修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒可具有至少一个非功能性的T-DNA边界序列(例如，可仅具有一个功能性T-DNA边界序列，或可没有功能性T-DNA边界序列)。在一些实施方式中，一旦该iiT-DNA进入植物细胞，则使iiT-DNA质粒的RB(不含LB或失活的LB)成为可移除的或失活的，从而进一步破坏T-DNA整合。在所述实施方式中，所述质粒在本文中称为可移除的右边界iiT-DNA(RRBiiT-DNA)质粒。如本文所述，RRBiiT-DNA可通过切点罕见核酸内切酶移除RB序列来获得。一般而言，切点罕见核酸内切酶可由修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒中包含的T-DNA序列中包括的结构编码序列之一编码。

本发明还提供一种在无T-DNA整合的情况下，采用如本文所述的修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒在植物细胞中进行基因编辑的方法，其中切点罕见核酸内切酶从所述质粒瞬时表达。所述切点罕见核酸内切酶可导向针对植物基因组中的特定基因座，从而其作用可导致位于该特定基因座处的遗传序列的突变、修饰或修复。