[发明专利]无T‑DNA整合的农杆菌介导的基因组修饰

权利要求书

1.在植物细胞中瞬时表达多肽的方法，所述方法包括将修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒引入所述植物细胞，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒包含T-DNA区域，该T-DNA区域包含：

(a)T-DNA边界序列；和

(b)包含5′启动子区域的多肽编码序列、编码所述多肽的结构编码序列，和包含聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中，所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，

从而所述多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒包含至少一个非功能性的T-DNA边界序列。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒仅包含一个功能性T-DNA边界序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒不包含任何功能性T-DNA边界序列。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒不包含右边界序列。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述引入步骤包含使易感植物细胞与能够进行水平基因转移的生物体接触。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述能够进行水平基因转移的生物体是细菌。

8.如权利要求2所述的方法，其中，所述细菌是农杆菌(Agrobacterium)。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列来自农杆菌。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列是T-DNA右边界序列。

11.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列来自真蛸碱Ti质粒、胭脂碱Ti质粒，或农杆碱Ti质粒。

12.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA包含重复且反向的序列。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述重复且反向的序列与所述边界序列毗连。

14.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA边界序列是所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒中的多肽编码序列的5′。

15.如权利要求1所述的方法，其中，所述5′启动子区域天然存在于植物细胞中或能够天然进入植物细胞。

16.如权利要求1所述的方法，其中，所述5′启动子区域包含组成型启动子。

17.如权利要求1所述的方法，其中，所述5′启动子区域包含诱导型启动子，并且其中，所述方法还包括诱导所述启动子。

18.如权利要求1所述的方法，其中，所述多肽编码序列编码切点罕见核酸内切酶或切点罕见核酸内切酶亚基。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述切点罕见核酸内切酶是转录激活因子样(TAL)效应物核酸内切酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶，或可编程的RNA导向的核酸内切酶。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述切点罕见核酸内切酶的瞬时表达导致定点诱变。

21.如权利要求1所述的方法，其中，所述修饰的Ti、Ri或T-DNA质粒包含与所述结构编码序列瞬时表达的报告基因。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述报告基因的表达导致视觉信号或抗生素抗性。

23.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA区域还包含供体序列。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述供体序列的瞬时递送导致基因靶向。

25.如权利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA区域还包含含有5′启动子区域的第二多肽编码序列，编码第二多肽的结构编码序列，和编码聚腺苷酸化信号的3′非翻译区域，其中，所述5′启动子区域和所述3′非翻译区域操作性地连接至所述结构编码序列，从而第二多肽编码序列在所述植物细胞中瞬时表达且不整合进入所述植物细胞的基因组。