[发明专利]用于核酸文库质量控制和定量的方法、系统和其组合物

说明书

下一代测序(NGS)工作流程需要良好的文库构建，以便在大规模平行测序策略中提供成功的结果。对良好DNA文库的要求包括以下要求：在工作流程的预备步骤中产生的多个双链核酸具有预先选择的长度范围，包括引物和接头序列，并且必须经定量足以确定有效文库加载到测序步骤中，由此在NGS工作流程中生成良好的测序数据。需要改善的工作流程、更简单的仪器需求和增加的检测灵敏度。这里所描述的方法可以应用于从任何方法获得的任何多个双链核酸，需要了解所述多个双链核酸的长度范围和其中所含材料的量，并且绝不限于NGS文库。

发明内容

在第一方面，提供一种用于测定多个双链核酸的长度范围的方法，其包括以下步骤：使多个双链核酸与a)第一染料和b)经可检测标记的单链大小确定梯在第一染料被配置成标记双链核酸的条件下接触；产生包含多个经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链大小确定梯的混合物；使混合物在移动性依赖分离条件下迁移；分离多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个；以及测定多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间。在各种实施例中，所述方法可另外包括测定经可检测标记的单链大小确定梯的多个片段中每一个的迁移时间。所述方法可另外包括将多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间转换成长度。在一些实施例中，转换步骤可包括以下步骤：比较经第一染料标记的双链核酸的迁移时间与经可检测标记的单链大小确定梯的至少一个片段的迁移时间。在一些实施例中，比较经第一染料标记的双链核酸的迁移时间与经可检测标记的单链大小确定梯的至少一个片段的迁移时间可包括比较经第一染料标记的双链核酸迁移时间与经可检测标记的单链大小确定梯的多个片段迁移时间。在各种实施例中，转换多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间可另外包括基于分配给经可检测标记的单链大小确定梯的每个片段的相关性因数分配每个经第一染料标记的双链核酸的长度。

在所述方法的各种实施例中，多个双链核酸可以是具有至少一部分双链结构的核糖核酸。

在所述方法的各种实施例中，第一染料可被配置成标记多个双链核酸的至少一个可检测部分。在一些实施例中，第一染料可被配置成标记多个双链核酸的相当大一部分。在各种实施例中，第一染料可以非共价标记多个双链核酸。在一些实施例中，第一染料可以非共价标记多个双链核酸中的每一个。在各种实施例中，第一染料可以作为嵌入染料标记多个双链核酸中的每一个。

在所述方法的各种实施例中，第一染料可被配置成基本上不标记单链核酸。

在所述方法的各种实施例中，第一染料具有式I结构：

其中X是O、S、Se或C(CH₃)；R¹是C₁-C₆烷基；n＝0、1或2；Y是--CH₂═CH₂-，其中p和q等于0或1，使得p+q＝1；K¹和K²是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K¹和K²组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；LINK是含有4至19个亚甲基(--CH₂--)的主链的脂肪族链，其任选地以一个或多个间隔穿插有杂原子，每个杂原子独立地是N、O或S，其中每个N杂原子另外经1-2个H或1-2个具有1至6个碳的烷基取代，所述烷基取代基可以是相同或不同的，限制条件是任何杂原子与另一杂原子分隔至少2个亚甲基，其中LINK的一个亚甲基端连接到吡啶鎓或喹啉鎓杂环的氮原子且LINK的另一个亚甲基端连接到A，除了在A是H或CH₃的情况下，LINK必须含有至少一个N杂原子；A是H、CH₃或具有式A结构：