[发明专利]用于在厌氧条件下生产衣康酸的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种用于通过发酵产生衣康酸的方法。本发明还涉及一种能够通过此方法获得的包含衣康酸的发酵液，并且涉及一种使用通过产生衣康酸的方法能够获得的衣康酸来产生药物、化妆品、食物、饲料或化学产品的方法。本发明还涉及一种能够产生衣康酸的重组细胞。

发明背景

衣康酸是通过多种微生物产生的不饱和C5二羧酸，其在化学和制药工业中可用作许多工业上相关的化合物的前体。由于其作为用于产生塑料的丙烯酸和甲基丙烯酸的替代物的可能性，将其用于产生聚合物是尤其令人感兴趣的。丙烯酸和甲基丙烯酸严重刺激和腐蚀皮肤和呼吸道。另一方面，衣康酸是无毒的且容易生物降解，并且出于这些原因，在上述产生中对衣康酸的需要预期将有所增加。

用于由糖产生衣康酸的当前发酵方法是使用氧作为最终电子受体来需氧地执行。需氧方法的产生率通常较低(＜1g/l/h)，并且取决于氧转移速率和/或消散所生成的热所需要的冷却能力。需氧方法的产率是受限的，因为底物可以通过呼吸作用完全氧化。此外，呼吸生成许多代谢能量，从而导致底物转化为微生物生物质，这也降低了产物产率。

因此，需要进一步改进衣康酸的产生方法，以使得在工业生物反应器中可以实现经济上可行的大规模产生。

发明概述

本领域已知衣康酸可以通过大肠杆菌过度表达来自土曲霉(Aspergillus terreus)的顺式乌头酸脱羧酶(cadA)来需氧地产生。在本文中，已证实由大肠杆菌进行的衣康酸产生通过以下来改进：经由过度表达柠檬酸循环的第一部分(柠檬酸合酶和乌头酸酶，例如来自谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的柠檬酸合酶(gltA)和乌头酸酶(acnA))，即经由过度表达编码参与柠檬酸循环的第一部分的酶的基因，从而增强前体的可得性；以及经由失活编码磷酸乙酰基转移酶(pta))和乳糖脱氢酶(ldhA)的基因来消除到乙酸和乳酸的天然代谢路径。

葡萄糖到衣康酸酯的转化是氧化反应，其导致NAD辅因子的净还原。使用呼吸作用在需氧条件下再生NAD。在厌氧条件下，必须采用替代方法来进行辅因子再生。

还证明了在衣康酸盐/酯在大肠杆菌中的厌氧发酵生产中通过共同产生乙醇和甲酸盐/酯或H₂和CO₂来改进的衣康酸盐/酯产生。出乎意料的是，当引入衣康酸盐/酯路径时，菌株在厌氧条件下开始产生大量的谷氨酸盐/酯。因此，消除谷氨酸盐/酯形成的策略可以用于进一步增加衣康酸盐/酯的产生。

因此，本发明涉及一种用于产生衣康酸或包含衣康酸的发酵液的方法，所述方法包括在适合的发酵培养基中，在例如导致衣康酸产生的条件下，发酵能够产生衣康酸的重组细胞，从而产生衣康酸，其中：

(a)重组细胞：(i)过度表达顺式乌头酸脱羧酶；并且(ii)过度表达柠檬酸循环的一部分和/或到乙酸(acetate)和/或乳酸(lactate)的天然代谢路径的活性减小；以及任选地，

(b)发酵在厌氧条件下进行。

此方法可任选地包括回收衣康酸。

本发明还涉及通过本发明的方法能够获得的包含衣康酸的发酵液。所述发酵液可包含衣康酸，其为由本发明的重组细胞分泌到发酵液中的衣康酸形式和/或包含在本发明的重组细胞内的衣康酸形式。发酵液可包含本发明的重组细胞或者可以是已去除此类细胞的发酵液。

另外，本发明涉及一种用于生产药物、化妆品、食品、饲料或化学产品的方法，所述方法包括：(a)通过本发明的方法制备衣康酸；和(b)使用所述衣康酸制备药物、化妆品或化学产品。

另外，本发明涉及能够产生衣康酸的重组细胞，其中所述重组细胞：(i)过度表达顺式乌头酸脱羧酶；并且(ii)过度表达柠檬酸循环的一部分和/或到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的活性减小。

附图简述

图1示出了在生物反应器中在30℃(圆形)或37℃(正方形)下培养的大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-C)的CFE中顺式乌头酸盐/酯到衣康酸盐/酯的转化。在测定混合物中的蛋白质浓度分别为5.8和4.3mg/mL。CadA的活性来源于线的斜率。