[发明专利]用于快速活微生物列举的光谱强度比(SIR)分析

说明书

单一染料荧光染色(使用膜缔合染料，例如FM 1‑43或FM 4‑64)以及强度和光谱发射二者的差异的组合可区分活细菌与灭活/死细菌且提供对混合群体中的活细菌的快速且准确检测。

相关申请的交叉引用

本申请案主张于2015年1月12日提出申请的美国临时申请案第62/102,506号的权益。

技术领域

本文描述快速测量样品中的活细菌数的方法。所述方法可用于例如以定量方式验证在许多工业中丰富的不同消毒程序(例如巴斯德灭菌(pasteurizing)、用氯处理、UV、臭氧)的效率且用于评价消耗用食物或水中的活生物体数。

背景技术

样品中的细菌水平对例如打算用于人类和动物消耗的食物和水来说极其重要。诸如水和饮料公司、食品业、制药等许多工业使用多种消毒方法来确保在消毒程序后没有细菌或最少量细菌存活于食品中。

活微生物的定量通常为基于细菌培养物生长的专门实验室程序。需要在长培育时间内维持固体和液体培养基上的微生物生长的特定条件，在培育时间结束时确定每单位体积的群落形成单位(CFU)数(例如CFU/ml)。在实验室中，CFU通常是根据样品的稀释次数和体积通过正规化所计数群落的总数来计算。此方法需要实验室设备、合格人员和可介于一天到一个月之间的长时间段。常用程序是将样品散布于琼脂板上，和将其培育数小时或有时数天的时段，且然后对生长于板上的群落数进行计数。对于未生长于固体培养基上的微生物和有时对于厌氧生物体，标准为“最大估计计数”(MEC)。(霍尔姆斯W.(Holms W.)，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)54:255-260(1968)；桥水L.(Bridgewater L.)，美国公共卫生协会(American Public Health Association)、美国给水工程协会(AmericanWater Works Association)和水环境联合会(Water Environment Federation)，用于检验水和废水的标准方法(Standard Methods for the Examination of Water andWastewater).由柳真W.莱斯(Eugene W.Rice)编辑.第22版.华盛顿(Washington,D.C.):美国公共卫生协会，2012)。此方法利用试管连续稀释和视觉检查液体透明度，随后计算起始微生物浓度。然而，需要培养细菌的方法较为缓慢、昂贵且可受细菌凝集、使生物体生长的培养基的类型以及死细胞和碎片存在的影响。另外，一些细菌在培养物中不生长。

因此，对于许多工业有利的是具有通过在不依赖于基于培养物的分析下区分活细菌与灭活细菌验证其消毒方案的快速工具。

发明内容

本发明方法利用单一染料荧光染色和分析来产生用于快速检测活细菌的新颖工具。在本发明方法中，组合强度和光谱发射二者的差异以区分活细菌与灭活细菌。

在一实施例中，本申请案提供用于区别经处理样品中的活细菌与灭活细菌的方法，其包括：用单一膜缔合染料对样品进行染色；用λ激发下的入射光照射样品；测量每一细菌细胞的(i)波长λ1下发射光的强度I1；和(ii)波长λ2下发射光的强度I2；计算比率I2/I1；和基于所计算I2/I1大于还是小于预定阈值，确定细菌细胞为活的还是灭活的。在另一实施例中，可对于整个样品而非对于每一细胞个别地实施此相同过程，以测量整个样品强度。

在一些实施例中，可使用荧光分析、流式细胞术和显微术。其它实施例(例如但不限于涉及流式细胞术和显微术的那些)采用单一细菌检测和定量。

欲分析的测试样品可为液体、半液体或干燥样品。在一实施例中，样品可从饮用水、食品或饮料获得。在不同实施例中，样品是从医药产品、个人护理产品或体液获得。体液可包含(但不限于)血浆、唾液、尿、咽喉样品或胃肠液。在另一实施例中，样品是从市政水系统、井、可饮水、废水、天然水源、改水或土壤获得。在不同实施例中，测试样品来自医疗装置。优选地，医疗装置是植入物、贴片或瓣膜。