[发明专利]减少引物二聚体扩增的方法

说明书

技术领域

本发明涉及在多重聚合酶链式反应(PCR)中减少引物二聚体扩增的方法。

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发明背景

多重PCR由单个PCR混合物中的多个引物组组成，从而生成对不同DNA序列特异的扩增子。通过一次性靶向多个基因，可由单个测试轮次获得额外信息，否则需要若干倍的试剂和努力才能完成。

降低多重PCR测定灵敏度的主要障碍之一是引物二聚体(PD)的累积。PD由彼此杂交的引物分子组成，杂交的原因是成串的互补碱基，特别是在引物的3’端。多重PCR反应中极高浓度下许多引物对的存在提高了引物二聚体形成的机会。一旦形成，短的PD倾向于非常有效地扩增，通过大量消耗引物和其他试剂潜在地抑制所需DNA序列的扩增。可通过不同方法的组合来减少PD形成，包括特别的引物设计和修饰方法、使用热启动Taq聚合酶、PCR添加剂和优化的PCR循环条件。

已报道多种用于减少PD形成的引物设计和修饰方法。Brownie等(Nucleic Acids Res，25(16)：3235-41，1997)描述了HANDS(同源标签辅助的无二聚体系统)。在HANDS PCR中，所有靶标特异性引物都在低浓度下在其5’端含有共有的尾部序列并在较高浓度下与单个尾部特异性引物混合。在至少两个循环的靶标特异性PCR后，对完全由尾部特异性引物驱动的后续扩增循环提高退火温度。结果是，来自所有PCR产物的单链(包括所需的扩增子和副产物如PD)都具有互补的5’和3’端，其导致形成相同的茎环结构。由于尾部序列的高局部浓度，短产物如PD中形成的茎环结构非常稳定且稳定程度超过尾部特异性引物的后续退火，导致PD扩增的抑制。然而，在所有引物各端均具有相同尾部序列的情况下，该方法需要靶扩增子足够的长以最小化真实靶产物上茎环的抑制作用。取决于高度多重PCR中靶扩增子的长度和组成，各扩增子的茎环的紧密度也发生变化，其可导致显著失衡的扩增。此外，该茎环可能没有足够稳定到抑制长引物之间的PD形成。

美国专利号5,792,607(Backman等)和美国专利申请公开号20140329245公开了使用内切酶IV切除引物的不可延伸3’，从而在特异性引物-模板杂交后激活引物。Dobosy等(BMC Biotechnol.11：80，2011)报道了RNA酶H依赖性PCR(rhPCR)方法，其使用RNA酶H切除位置靠近阻断的引物的3’端的单个RNA碱基，从而在特异性引物-模板杂交后激活引物。该方法最近由IDT(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)，美国专利申请公开号2009/0325169，PCT/US2012/030413)商业化。所有这些方法都需要引物中修饰的碱基和用于引物激活的额外酶，这导致较高的成本。

Peleg等(Appl.Environ.Microbiol.，75：6393-6398，2009；WO/2009/004630)报道了PCR中的DNA-RNA嵌合引物减少PD形成。双启动寡核苷酸(DPO)引物(希捷科技(Seegene Technologies))已被报道用以减少PCR PD形成(Chun等，Nucleic Acids Res.35(6)：e40，2007)。DPO包含两个单独的启动区域(5’端稳定子(stabilizer)和3’端决定子(determiner))，其通过聚脱氧肌苷接头接合。由于存在包含聚脱氧肌苷接头的弱氢键的“气泡”样结构，DPO引物3’端处的诸如PD的引物非特异性杂交减少。嵌合引物中的上述RNA碱基和DPO引物中的聚脱氧肌苷接头显著增加了引物制造的复杂程度和成本。

Scatterfield(J.Mol.Diagn.，16：163-173，2013)报道了由两条DNA序列组成的合作引物(cooperative primer)，这两条DNA序列通过5’至5’或5’至3’的聚乙二醇接头接合。结果显示使用合作引物的单重PCR反应在添加的引物二聚体存在的情况下显著减少了引物-引物增殖。