[发明专利]减少引物二聚体扩增的方法

权利要求书

1.一种减少多重聚合酶链式反应(PCR)中引物二聚体扩增的方法，包括以下步骤：

(a)获得第一核酸序列，所述第一核酸序列包含第一标签(t1)和与第一靶核酸片段互补的第一正向引物(F1)，

(b)获得第二核酸序列，所述第二核酸序列包含第二标签(t2)和与所述第一靶核酸片段互补的第一反向引物(R1)，

(c)获得第三核酸序列，所述第三核酸序列包含第三标签(t3)和与第二靶核酸片段互补的第二正向引物(F2)，

(d)获得第四核酸序列，所述第四核酸序列包含所述第一标签(t1)、与所述第二靶核酸片段互补的第二反向引物(R2)以及所述第一标签(t1)与所述第二反向引物(R2)之间的所述第一正向引物(F1)的5’端部分序列(F1∧)或全长序列，其中所述第一正向引物(F1)和所述第二反向引物(R2)在其3’端具有互补区域，F1∧具有5’端部分F1序列的40-90％或3-30个核苷酸，

(e)混合所述第一和第二靶核酸片段、所述第一、第二、第三和第四核酸序列以及有效量的进行聚合酶链式反应(PCR)必需的试剂；以及

(f)进行PCR。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(f)包括：

(f1)激活DNA聚合酶并使(e)的混合物中的DNA变性，

(f2)通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对(f1)的混合物循环多次以获得扩增产物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(f)包括：

(f-i)激活DNA聚合酶并使(e)的混合物中的DNA变性，

(f-ii)通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对(f-i)的混合物循环至少两次，以及

(f-iii)在高于步骤(f-ii)中退火温度的退火温度下，通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对(f-ii)的混合物循环多次以获得扩增产物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(f-iii)中的退火温度比步骤(f-ii)中的退火温度高4-35℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其中标签t3和t2的序列相同。

6.根据权利要求1所述的方法，其中标签t3和t2的序列均不同于标签t1的序列。

7.根据权利要求1所述的方法，其中F1∧具有5’端部分F1序列的3-30个核苷酸。

8.根据权利要求4所述的方法，其中F1∧具有5’端部分F1序列的3-30个核苷酸。

9.根据权利要求1所述的方法，其中F1∧具有5’端部分F1序列的40-90％。

10.根据权利要求4所述的方法，其中F1∧具有5’端部分F1序列的40-90％。

11.根据权利要求1所述的方法，其中F1、F2、R1和R2是基因特异性引物。