[发明专利]CRISPR/Cas9靶向敲除人乙肝病毒P基因及其特异性gRNA

说明书

本发明属于基因工程技术领域，更具体地说，本发明涉及基于CRISPR/Cas9系统的向导RNA（gRNA）序列及其组合在用于特异性靶向敲除乙型肝炎病毒cccDNA P基因的gRNA。本发明根据CRISPR/Cas9的设计原则，设计了30个gRNA，其序列表见SEQ ID NO.1‑30所示，并且将其构建在PX458载体上，筛选出4个最高效率的gRNA。在人肝癌细胞株(HepG2.2.15)中利用这4条gRNA及其组合指导的CRISPR/Cas9系统，可以有效的敲除人乙型肝炎病毒cccDNA P基因。利用本发明制备的特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的gRNA能够精确靶向乙型肝炎病毒cccDNA并且实现基因敲除。该制备方法操作简单、gRNA靶向性好，CRISPR/Cas9系统的敲除效率高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及CRISPR/Cas9特异性敲除人乙肝病毒P基因的方法以及用于特异性靶向人乙肝病毒P基因的gRNA。

背景技术

乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，HBV能够引发慢性肝炎、急性肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。HBV是世界范围性的流行性疾病，全球约有3.5～4亿人感染慢性HBV，在我国，HBV的感染率高达60%~70%，有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。乙型肝炎治疗的目的是减轻肝脏病变，防止或延缓发展为肝硬化、肝癌，最终目标是彻底清除病毒，达到完全治愈。除一般的保护肝脏和免疫调节治疗外，抗病毒治疗是肝炎治疗的重点也是难点。到目前临床应用的抗HBV药物有两大类: 干扰素及核酸类似物，由于HBV易突变，耐药突变株在不断的出现，使得现有的抗HBV药物难以达到理想的治疗效果。

HBV基因组结构高度浓缩，结构基因与调节基因之间重叠，甚至结构基因序列之间也相互重叠，有不同的变异株，但每个病毒株的L(-)链均含有4个开放读码框，分别是S、C、P、X区。其中P-ORF是HBVDNA序列中最长的ORF，编码的P蛋白是对病毒生活周期起重要作用的多功能酶，参与病毒基因组复制的全过程，每一个结构域在基因组复制过程中都发挥不同的作用。由于P蛋白的重要性，使其成为抗病毒药物的主要靶点。

CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统，具有的快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势，为高效靶向敲除HBV P-ORF，实现乙型肝炎及其相关疾病的治疗提供了一种可能的选择。本发明的目的就是要验证利用CRISPR-Cas9 高效靶向敲除HBV P-ORF，提供相应的技术方案，达到特异性敲除HBV P-ORF的目的。

发明内容

本发明的目的在于通过设计、构建、筛选，最终提供一些基于CRISPR/Cas9系统，同时靶向人乙型肝炎病毒P基因的高效gRNA及其靶位点序列，并用其抑制人乙型肝炎病毒P基因的表达，从而抑制乙型肝炎病毒的增值。

为实现上述目的，本发明以CRISPR/Cas9系统原理及其gRNA的设计原理为基础，软件设计预测，设计出一系列的gRNA，并以PX458为表达载体，构建了gRNA/Cas9表达系统。通过筛选和一系列的分析测试，最终筛选出4个针对基因组靶点有效的gRNA，并在HepG2.2.15细胞模型中加以应用。

本申请的技术方案如下

1、靶向人乙型肝炎病毒P基因的高效gRNA及其靶点序列的设计及gRNA/Cas9表达系统构建；

2、在HepG2.2.15细胞模型中，分析检测gRNA指导的CRISPR系统对于人乙肝病毒cccDNA靶位点敲除效率，筛选到8条较高效的gRNA；