[发明专利]CRISPR/Cas9靶向敲除人乙肝病毒P基因及其特异性gRNA

权利要求书

1.在CRISPR/Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA P基因中用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA P基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA在乙型肝炎病毒cccDNA P基因上的靶向位点序列如序列表SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11任意一条序列所述。

2.根据权利要求1所述的在CRISPR/Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA P基因中用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA P基因的gRNA，所述 gRNA 在乙型肝炎病毒cccDNA P基因的靶序列符合 5’- N (20)-NGG3’ 或者 5’-CCN- N (20)N-3’的序列排列规则，在乙型肝炎病毒cccDNA P基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述 gRNA 在人乙型肝炎病毒P基因的靶向位点位于人乙型肝炎病毒P基因外显子上。

3.根据权利要求1所述的在CRISPR/Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA P基因中用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA P基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA在乙型肝炎治疗中具有广泛的应用前景。

4.CRISPR-Cas9 特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA P基因的方法，具体涉及如下步骤 ：

（1）根据权利要求 1-3 任意一项所述的 gRNA，在其对应DNA 序列的5’末端加上 CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的 5’末端加上 AAAC 得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有 BbsI 粘性末端的双链 DNA 片段；

（2）将步骤（1）中合成的双链 DNA 片段和用 BbsI 酶切过的PX458 载体进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，涂布于带有氨苄青霉素抗性的LB平板上，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行分析及测序，确定gRNA 表达载体构建成功，命名为PX458-gRNA-P1；

（3）将步骤（2）构建的gRNA载体转染HepG2.2.15细胞，并用PX458空载体转染HepG2.2.15 细胞作为对照组。