[发明专利]一种从发酵液中分离纯化环孢菌素A的方法

说明书

本发明提供一种从发酵液中分离纯化环孢菌素A的方法，包含以下步骤：(1)环孢菌素A的提取；(2)大孔吸附树脂层析；(3)PS30RPC型聚合物纳米微球柱层析；(4)结晶纯化洗脱液真空浓缩并结晶，用冷丙酮石油醚洗涤，最后真空干燥得无色粉末状环孢菌素A纯品。本发明方法经发酵液提取、非极性大孔吸附树脂层析、PS30RPC型聚合物纳米微球柱层析、结晶纯化得纯度大于98.5％环孢菌素A，收率为70％以上。本发明采用等浓度洗脱，没有复杂的中间步骤溶剂置换过程，工艺操作简捷，适于工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种环孢菌素A的分离纯化工艺。

背景技术

环孢菌素A(Ciclosporin A，CsA)是从多孔木霉(Tolypocladium inflatumCSP3)，后正名为雪白白僵菌(Beauveria bassiana)的培养物中分离得到的一种含11个氨基酸的环状多肽，是一种作用很强的免疫抑制剂，除了环孢菌素A外还有B、C、D等20多种同系物。环孢素A用于肾脏、肝脏和心脏等移植手术的免疫抑制治疗，它还可以用来治疗一些自身免疫疾病，如红斑狼疮、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、重症肌无力、慢性肾炎、慢性活动性肝炎和肾病综合症等多种自身免疫性疾病。

环孢菌素A发酵产品中的主要杂质是结构相似的环孢菌素A同系物，包括B、C、D等，现有技术中对于环孢菌素A的提取纯化主要工艺路线是先用有机溶剂提取，然后通过不同类型的柱层析进行分离纯化。

CN200510108097.9描述了一种首先得到环孢菌素粗晶体，再利用柱层析分离纯化环孢菌素A，并进行二次结晶的纯化工艺，该方法粗结晶工艺复杂，使用有机溶剂种类多，有些溶剂价格较贵，而且结晶需要3天，整个纯化工艺耗时长。US5656459公开了一种提取纯化工艺，先用甲醇提取，去除甲醇再将提取物溶于乙酸乙酯，通过两次硅胶柱层析获得环孢菌素A纯品，该工艺提取与硅胶层析所用溶剂不能衔接，需要转换，而且硅胶层析次数多，总收率低。

US5382655公开了一种用氯仿、二氯甲烷和乙醇作为流动相分离纯化环孢菌素A的硅胶柱层析方法，但这些溶剂毒性大，对环境不友好。专利US597638公开了一种利用高压二氧化碳作为流动载体通过硅胶柱层析获得环孢菌素A的方法，但该方法对设备要求高，样品处理量少，无法实现大规模规模化生产。专利US2002/0162789A1公开了一种用多步硅胶色谱分离，流动相甲苯和乙酸乙酯，主要缺点是甲苯毒性大，色谱步骤多，溶剂耗量大。WO01/64935A1描述了一种利用有机溶剂提取、凝胶过滤和硅胶柱层析分离纯化环孢菌素A的方法，该方法主要缺点是凝胶过滤填料价格昂贵，而且各个步骤间都需将前一步的溶剂去除，工作量大，溶剂消耗多。US2003/0186856A1采用葡聚糖凝胶通过两次层析分离纯化环孢菌素A的方法，主要问题是填料价格贵，成本高。CA2108655提供了一种采用超流体萃取技术分离环孢菌素A的方法，该方法投资大，成本高，不适用于工业化生产。

综合公开专利的主要特点是先用有机溶剂进行萃取，然后利用一步或多步硅胶柱层析进行分离纯化，有些分离纯化工艺成本高，不适用于工业化生产，有些工艺溶剂毒性大，消耗量大，而且总收率大约40％～60％。

《中国抗生素杂志》文章(编号：1001-8689(2008)05-0276-04)报道利用大孔吸附树脂HP结合高速逆流色谱分离环孢菌素小组分，能够对环孢菌素实现富集再分离，但该方法处理规模小、设备要求高，不利于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大规模、高效工业化提纯高纯度环孢菌素A的新方法。