[发明专利]一种从发酵液中分离纯化环孢菌素A的方法在审
| 申请号： | 201611241709.6 | 申请日： | 2016-12-29 |
| 公开（公告）号： | CN108250275A | 公开（公告）日： | 2018-07-06 |
| 发明（设计）人： | 闻建华;闻铭远;傅红 | 申请（专利权）人： | 天津领世生物科技开发有限公司 |
| 主分类号： | C07K7/64 | 分类号： | C07K7/64;C07K1/34;C07K1/16;C07K1/14 |
| 代理公司： | 天津盛理知识产权代理有限公司 12209 | 代理人： | 韩晓梅 |
| 地址： | 300382 天津市西青*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 环孢菌素A 聚合物纳米 分离纯化 结晶纯化 发酵液 柱层析 微球 非极性大孔吸附树脂 大孔吸附树脂层析 溶剂置换过程 发酵液提取 石油醚洗涤 工艺操作 真空浓缩 中间步骤 冷丙酮 洗脱液 无色 层析 收率 洗脱 | ||
1.一种从发酵液中分离纯化环孢菌素A的方法，其特征在于：其过程包含以下步骤：
(1)环孢菌素A的提取
向发酵液中加NaOH调PH值为中性，加入有机溶剂，搅拌提取5～8小时，将提取液滤出菌体收集滤液，所述有机溶剂是甲醇、乙醇和丙酮中的一种或多种；
(2)大孔吸附树脂层析
用型号为HZ816、HP20、X-5或H103的非极性大孔吸附树脂装柱，对树脂进行预处理，提取液上样，用洗涤剂处理上样后的树脂，然后洗脱液洗脱并收集洗脱液，减压浓缩去除有机溶剂或减压浓缩去除有机溶剂加入乙酸乙酯萃取含环孢素A的水溶液再减压浓缩去除有机溶剂，得浓缩物待用；
(3)PS30RPC型聚合物纳米微球柱层析
将PS30RPC型聚合物纳米微球装柱，将萃取浓缩液上样，用丙酮，乙酸乙酯与水的混合溶剂洗脱，收集纯度合格的环孢菌素A洗脱液；
(4)结晶纯化
洗脱液真空浓缩并结晶，用冷丙酮石油醚洗涤，最后真空干燥得无色粉末状环孢菌素A纯品。
2.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离纯化环孢菌素A的方法，其特征在于步骤(1)发酵液与有机溶剂的体积比为1:1～1:2；步骤(1)有机溶剂是丙酮；步骤(1)发酵液提取温度为30℃～40℃。
3.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离纯化环孢菌素A的方法，其特征在于步骤(2)所用大孔吸附树脂型号是HZ816；步骤(2)预处理树脂所用的洗涤剂依次是纯水、5％氢氧化钠溶液和5％盐酸溶液；步骤(2)上样后的树脂洗涤剂为50-60％丙酮溶液；步骤(2)洗脱剂为乙酸乙酯、甲醇和丙酮中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离纯化环孢菌素A的方法，其特征在于步骤(3)大孔树脂层析所选用的粒度为200-300目和100-200目中的一种或两种；步骤(3)大孔树脂柱层析柱高径比为8:1～12:1；步骤(3)PS30RPC型聚合物纳米微球柱层析柱高径比优选10:1；步骤(3)上样液为10％～30％柱体积；步骤(3)上样液为10％柱体积；步骤(3)大孔树脂柱层析中洗脱液配比为体积比丙酮:水＝50～62：50～38；步骤(3)PS30RPC型聚合物纳米微球柱层析中洗脱液配比优选为体积比丙酮:乙酸乙酯：水＝60：8：32。
5.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离纯化环孢菌素A的方法，其特征在于步骤(4)大孔树脂柱层析洗脱液真空浓缩温度为40℃～60℃。
6.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离纯化环孢菌素A的方法，其特征在于步骤(4)环孢菌素A的结晶温度为-5℃～-20℃。
7.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离纯化环孢菌素A的方法，其特征在于步骤(4)环孢菌素A的结晶温度为-10℃。
8.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离纯化环孢菌素A的方法，其特征在于步骤(4)环孢菌素A的真空干燥温度为40℃～60℃。
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