[发明专利]一种纯化脂肪酶的筛选方法

说明书

技术领域

本发明既属于萃取技术领域，又属于生物技术领域，具体涉及一种利用脂肪酶在不用溶液中溶解度不同进行萃取反应，能够快速、方便、耗资低的萃取出纯酶的方法，该方法具有操作方便、快速、成本低廉等特点。

背景技术

脂肪酶是重要的工业酶制剂之一，存在于生物中的一类特殊酯键水解酶，既可作用于酯键，又是一类界面酶和高效催化剂，广泛应用于食品、能源、医药、农业、精细化工和生物修复等行业领域。因为其具有独特的优越性，成为了近年来国内外研究的热点。

脂肪酶分离纯化一直是脂肪酶研究中很重要的一个环节，其分离纯化效果直接影响酶结构分析，酶特性与功能分析等。在进行分离纯化操作的过程中，不仅要保证脂肪酶的生物活性、产率和纯度，还要求分离所需成本低廉，检测方便。纯化脂肪酶的常规方法包括了沉淀法、吸附层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等。沉淀法只适合纯化初期，后期仍需其它大量方法辅助且其纯化率低。层析法纯化脂肪酶，其灵敏度较高，但是一般纯化过程至少需要两个层析方法，层析柱价格昂贵，使用次数越多纯化效果越差，需要摸索层析条件且纯化耗时较久，操作繁琐。综上所述，建立一种快速、准确、低成本和易操作的脂肪酶纯化方法是非常必要的。

发明内容

本发明提供了所述的重组高产脂肪酶菌Penlcillium sp.Y-29。

为了解决上述技术问题，本发明利用脂肪酶在不用溶液中溶解度不同进行萃取反应的方法。该方法具有快速、准确、易操作和成本低等特点，本发明保证了萃取过后为纯酶。

本发明提供了一种脂肪酶的纯化方法。本发明是通过以下技术方案实现的，利用脂肪酶在不同溶液中溶解度不同发生萃取反应，经透析，冷冻干燥，根据凝胶电泳进行分析。该方法在冰浴条件下进行操作，脂肪酶纯化方法操作步骤如下：

(1)取一瓶发酵液进行无菌抽滤，取其滤液即酶液。双水相构成为萃取剂A(12％-16％)与萃取剂B(14％-22％)，将2.0g酶液和3毫升双重水加入含有双水相的刻度试管中，共计8.0g左右。在漩涡混匀器上震荡3分钟，于4℃下静置1小时，进行萃取。

(2)将收集的上相液体分装于50毫升离心管中，15毫升每管。冰浴条件下，缓慢加入萃取剂C，体积比为1∶1，混匀(由于有机试剂萃取时极易出现乳化现象，在震荡时如果出现乳化现象可加入少量的冷石油醚以促进分层)，低温静置。分层后，收集离心管中水相。

(3)采用8000-14000截留率的透析袋，在PBS 7.0冰浴下，对上清液进行透析。

其中步骤(1)所述方法，萃取剂A为硫酸铵、磷酸氢二钾、酒石酸钾钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的一种；萃取剂B为PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000的一种；萃取剂C为甲醇、丙醇、丁醇、二氯甲烷、石油醚的一种。

本发明的有益效果：

1、本发明所述的纯化过程中，采用最少的原材料，最短的时间，达到最终效果。

2、本发明所述的纯化过程中，所用到的材料均可回收利用，对环境无污染。

3、本发明的一种脂肪酶的纯化方法，具有操作方便、快速、准确和成本低廉等特点。

附图说明：

图1、纯化过后脂肪酶的电泳图

具体实施方式

本发明所涉及的验证方法菌株为重组高产脂肪酶菌Penicillium sp.Y-29。

本发明涉及的菌株重组Penicillium sp.Y-29具有如下微生物学特征：

1.形态特征

分生孢子梗壁光滑，帚状枝具有单束的小梗，密集，菌丝有横隔，孢子成束状或链状，链长而纠结，单个孢子为球形，肾形，直径为3-3.5μm。

2.平板固体培养基上的菌落特征(30℃，36h)

圆形，1-4mm；培养基初期表面带丝状，呈绿色。

3.生长环境

最适生长温度32℃，最适生长pH 6.5，生长温度范围为20-48℃。

实施例1：双水相萃取分析