[发明专利]基于UPLC/LTQ‑OrbitrapVelosMS检测石斛生物碱成分的方法

权利要求书

1.基于UPLC/LTQ-Orbitrap Velos MS检测石斛生物碱成分的方法，包括以下步骤：

1)将石斛待测样品杀青后烘烤；所述石斛为铁皮石斛；

2)将所述步骤1)烘烤后的石斛与有机溶剂混合后磨碎，得到石斛浆液；所述的有机溶剂包括甲醇、乙醚或丙酮；

3)将所述步骤2)得到的石斛浆液进行超声破碎，固液分离后，得到上清液；

4)将所述步骤3)得到的上清液进行浓缩，得到提取物干粉；

5)将所述步骤4)得到的提取物干粉与硫酸溶液混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值至9.5～10.5，将得到的碱性混合液静置；

6)将所述步骤5)静置后的碱性混合液与二氯甲烷混合，离心，得到二氯甲烷相；

7)将所述步骤6)得到的二氯甲烷相浓缩，得到生物碱干粉；

8)将所述生物碱干粉用甲醇复溶，固液分离后得到游离生物碱待测样品；

9)用超高效液相色谱分离所述游离生物碱待测样品，将分离后的生物碱成分用质谱检测，得到生物碱成分物质峰；

10)用OSI/SMMS软件对所述生物碱成分物质峰进行定性分析；

所述步骤9)中色谱分离条件包括如下参数：

色谱柱为Hypersil GOLD液相色谱柱；所述Hypersil GOLD液相色谱柱的规格为2.1mm×100mm×1.9μm；

柱温为40℃；

洗脱系统流动相A为体积比0.1％甲酸水溶液，流动相B为体积比0.1％甲酸乙腈溶液；

洗脱的流速为0.35mL/min；

进样体积为5μL；

流动相梯度洗脱程序：

(0,1min)，流动相A与流动相B的体积比19：1的混合液；

[1min,24min)，流动相A与流动相B的体积比为恒定值，所述恒定值的范围为1：19～19：1；

[24min,28min)，流动相A与流动相B的体积比为1：19；

[28min,28.1min)，流动相A与流动相B的体积比为恒定值，所述恒定值的范围为1：19～19：1；

[28.1,30min]，流动相A与流动相B的体积比为19：1；

所述石斛生物碱成分为裘波树碱、颠茄次碱、猕猴桃碱、常绿钩吻碱、阔叶狗舌草碱、酸浆双古豆碱、黄小檗碱、别隐品碱、荷花碱、结乌头根碱、垂石松碱、红豆裂碱、番木瓜碱、富贵草碱、飞廉碱和双青藤碱，还包括具有式Ⅰ的化合物1，具有式Ⅱ的化合物2、具有式Ⅲ的化合物3、具有式Ⅳ的化合物4、具有式Ⅴ的化合物5和具有式Ⅵ的化合物6；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中杀青的温度为100～110℃；杀青的时间为15～25min。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中烘烤的温度为50～65℃；所述烘烤至恒重。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中石斛的质量与有机溶剂的体积比为(50～80)mg：(1～2)mL。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中超声的温度为25～30℃；超声的时间20～40min；所述超声的功率为100～150W。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤4)和步骤7)中浓缩为氮气吹干浓缩；

所述浓缩的时间为40～100min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤5)中提取物干粉的质量与硫酸溶液的体积比为(7～11)mg：(1～2)mL；

所述硫酸溶液的体积浓度为8％～12％。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤6)中碱性混合液与二氯甲烷的体积比为2～3：1～2；

所述步骤6)中所述离心的转速为3500～5000rpm；

所述步骤6)中所述离心时间为15～20min。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤9)中质谱检测条件包括以下参数：

离子源为电喷雾离子源，正离子模式检测；

鞘气，30自由单位；辅助气，6自由单位；

喷雾电压，3.8kV；

离子传输毛细管温度为350℃，源加热温度为350℃；

母离子扫描范围：50-1000m/z，数据依赖的扫描模式，每次全扫描后采集最强的5个碎片图谱进行二级质谱扫描；

碎裂方式：碰撞诱导解离，正态化能量30％，q值0.25，活化时间为30ms，动态排除时间为5s；

一级质谱在m/z400时分辨率为30000，二级质谱在m/z400时分辨率为30000。