[发明专利]一种测定金银花大鼠血清代谢产物的方法

说明书

本发明公开了一种测定金银花大鼠血清代谢产物的方法，通过对净化剂类型和提取净化程序进行了系统优化，建立了QuEChERS技术处理大鼠血清样品的方法；通过RRLC‑ESI‑MS‑MS技术对金银花代谢产物中7种成分进行定性定量测定，计算其回收率。该技术简单、快速、准确、有效，为复杂基质中药大鼠血清代谢产物的提取净化和分析研究提供了新方法。

技术领域

本发明属于分析测试领域，具体涉及一种利用QuEChERS-RRLC-ESI-MS/MS法测定金银花大鼠血清代谢产物的方法。

背景技术

金银花Lonicera japonica Flos.为忍冬科植物，忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、凉散风热的作用。现代药理及临床研究表明，金银花具有抗病原微生物、抗炎、解热、保肝、抗生育、止血、免疫调节、降血脂、中枢兴奋等作用。对金银花入血后的代谢产物进行分析，有助于阐明金银花的药效成分。但代谢产物基质复杂，特别是含有脂质和蛋白质等内源性杂质，这给代谢产物的分析带来巨大困难。因此，需要发展一种合适的提取净化方法，对血液样品进行快速、有效的前处理。

QuEChERS(Quick快速、Easy简便、Cheap廉价、Effective有效、Rugged耐用、Safe安全)法，是2003年由Anastassiades教授开发的一种快速样品前处理技术，常用于水果蔬菜的农残检测。其原理与固相萃取(SPE)相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。该技术使用的主要吸附萃取剂为乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18和石墨化碳(GCB)。其中PSA能有效地去除样本基质中的脂肪酸、糖类等极性杂质，C18能去除部分非极性脂肪和脂溶性杂质，而石墨化碳对样本基质中的色素、固醇类杂质的去除极为有效。近年来QuEChERS法在食品安全检测中得到广泛应用，在血清样品前处理中也逐渐有探索报道，但对中药血清代谢产物的提取净化和分析的研究应用较少。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的为提供一种利用QuEChERS-RRLC-ESI-MS/MS法测定金银花大鼠血清代谢产物的方法，经检测发现，金银花在血清中的代谢产物包括马钱酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸C和槲皮素，本发明的检测方法中对吸附萃取剂进行了优化，该吸附萃取剂可以最大限度除去血清中存在的内源性干扰杂质，避免了对金银花血清代谢产物检测的干扰作用，提高了检测的准确度，并且采用RRLC-ESI-MS/MS联用的检测方法，通过优化各个参数，获得了较高的灵敏度，可以成功实现大鼠血清中马钱酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸C和槲皮素的分离检测。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种利用QuEChERS-RRLC-ESI-MS/MS法测定金银花大鼠血清代谢产物的方法，包括对含有马钱酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸C和槲皮素的大鼠血清进行前处理的步骤，向设定体积的大鼠血清中加入提取试剂，震荡、离心后，取上清液，并向上清液中加入内标物和吸附萃取剂，震荡萃取、离心，取上清液过固相萃取小柱，流出液经过滤后待检。

其中，每毫升大鼠血清所用的吸附萃取剂由以下组分组成：C18 3.5～4.5mg、PSA1.7～2.1mg和GCB 1.8～2.2mg。

由于大鼠血清中的干扰杂质较多，如果只采用单一的吸附萃取剂难以彻底除去干扰物质。发明人经过反复试验发现，当三种吸附剂为以上配比时，不但会完全吸附大鼠血清中的干扰物质，还能最大限度降低对目标物质的吸附。所以，利用该吸附萃取剂对含有金银花代谢产物的大鼠血清进行前处理时，可以大大提高对目标物质的检测准确度。

优选的，每毫升大鼠血清所用的吸附萃取剂由以下组分组成：C18 4mg、PSA 2mg和GCB2mg。