[发明专利]细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法

说明书

本发明细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法，包括以下步骤：⑴采用密度梯度离心法分离血液单个核细胞；⑵将新鲜分离的血液单个核细胞以1～20×10⁵cells/ml接种于完全RPMI1640培养基中进行培养并使用细胞因子组合刺激；⑶将培养装置置于37℃、5%CO₂培养箱中的摇床上进行动态培养；⑷根据细胞密度调整培养基及细胞因子组合的补加速率，通过采用逐级增大的培养装置控制培养体积为培养装置总体积的8～40%，进行动态悬浮培养；本发明通过改善CIK体外培养环境，调整培养基及细胞因子补加速率，减少了因培养环境对细胞生长的影响，能维持培养过程中细胞的密度，有效促进CIK体外扩增效果及稳定性。

技术领域

本发明涉及现代生物技术研究技术领域，涉及免疫细胞体外培养的技术，具体地说，是一种对细胞因子诱导杀伤细胞进行动态悬浮培养的方法。

技术背景

近年来，恶性肿瘤的发病率日益增大，且死亡率极高，严重危害人类健康，因此，对恶性肿瘤的研究和治疗越来越成为令人关注的领域。继传统的手术治疗、化疗和放疗三大常规治疗方法之后，过继性免疫细胞治疗也成为一种重要和有效的对恶性肿瘤的治疗技术。过继性免疫细胞治疗的定义为：将体外扩增和活化的免疫细胞重新输（注）入患者体内以消除癌细胞的过程，其目的在于重建免疫系统对癌细胞的识别并对癌细胞进行有效的杀伤。其中，细胞因子诱导杀伤细胞（Cytokine-induced killer，简称“CIK”）因具有增殖速度快、杀癌活性高、抗凋亡特性及杀癌效应不受癌细胞多重耐药的影响等独特优势而成为新一代恶性肿瘤过继性免疫细胞治疗的主力军。目前，细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）在恶性肿瘤过继性免疫细胞治疗中的应用已从实验室研究进入到了临床试验。

细胞因子诱导杀伤细胞是将来源于外周血、脐血的单个核细胞在体外用多种细胞因子，例如抗CD3单克隆抗体、白细胞介素2和γ型干扰素等共同培养一段时间后获得的一群异质性淋巴细胞群，其中，起主要作用的效应细胞为CD3⁺CD56⁺细胞。细胞因子诱导杀伤细胞通过非主要组织相容性复合物（Major histocompatibility complex，简称“MHC”）限制性的自然杀伤机制能裂解多种癌细胞，作为过继性免疫细胞治疗的一种效应细胞能用于治疗包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴性白血病等多种疾病。

过继性免疫细胞治疗成功的关键在于是否能够获得足够数量的效应细胞。细胞因子诱导杀伤细胞的临床剂量一般在10¹⁰～10¹¹之间，因此，如何在短期内获得足够数量、具有高肿瘤杀伤活性的细胞因子诱导杀伤细胞是决定其临床治疗能否成功的关键所在。

CIK传统的体外培养应用的较广泛的培养系统是静态培养体系，如孔板、方瓶等。所述静态培养体系具有结构简单、成本低、操作简便，易于观察等优点；但是，所述静态培养体系存在环境不均一，导致pH、溶氧和代谢产物等存在浓度梯度，会给CIK体外扩增带来不利影响。

此外，CIK传统的体外培养过程是采用定期（2～4天）半量换液方式补充营养物质，稀释代谢产物的。由于在培养过程中细胞密度不断变化，培养基中各营养成分的消耗以及代谢副产物的生成速率不尽相同，因此，无法根据细胞密度的变化调整培养基的补料速率，这可能会导致培养基的局部环境过酸或营养匮乏，从而影响CIK的扩增效果以及扩增后细胞的功能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法，它通过调整培养基以及细胞因子补加速率，维持培养过程中的细胞密度，能有效促进细胞因子诱导杀伤细胞体外扩增效果以及稳定性。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案。

一种细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法，包括以下步骤：

（1）采用密度梯度离心法分离血液单个核细胞；

其特征在于：