[发明专利]细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法

权利要求书

1.一种细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法，其特征在于，所述细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法包括以下步骤：

(1)采用密度梯度离心法分离血液单个核细胞；(2)将步骤(1)新鲜分离的血液单个核细胞以1～20×10⁵cells/ml接种于完全RPMI1640培养基中进行培养并使用细胞因子组合刺激；

(3)将培养装置置于37℃、5％CO₂培养箱中的摇床上进行动态悬浮培养，摇床转速为50～130rpm；

(4)根据细胞密度调整培养基及细胞因子组合补加速率，通过采用工作体积逐级增大的培养装置，维持培养体积为培养装置总体积的8％～40％，进行动态悬浮培养：

每天取样计数；

计数后计算细胞密度并根据细胞密度补加含有500IU/ml IL-2的完全RPMI1640培养基，将细胞密度重新调整至1～20×10⁵cells/ml；

连续培养至第14天，即可获得细胞因子诱导杀伤细胞；其中，

步骤(2)所述的细胞因子组合为：

IFN-γ(γ型干扰素)1000IU/mL，在接种时添加；

anti-CD3mAb(抗CD3单克隆抗体)50ng/mL，在接种24小时后添加；

IL-2(白细胞介素2)500IU/mL，在接种24小时后及后续培养过程中每天添加；

PHA(植物凝集素)500ng/mL，在接种24小时后添加；

IL-1α(白细胞介素1α)100IU/mL，在接种24小时后添加。

2.根据权利要求1所述的细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法，其特征在于，步骤(3)所述的培养装置为摇瓶或方瓶的一种。

3.根据权利要求2所述的细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法，其特征在于，所述培养装置装液量的范围为培养装置总体积的8％～40％。

4.根据权利要求3所述的细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法，其特征在于，在培养过程中补加培养基使得培养体系体积增加，当培养体积超过培养装置总体积的40％时，将细胞培养液转移至更大体积的培养装置，装液量仍控制在培养装置总体积的8％～40％的范围内。

5.根据权利要求4所述的细胞因子诱导杀伤细胞动态悬浮培养的方法,其特征在于，随着培养体积的增加，将摇床的转速从50rpm逐步调整到130rpm。