[发明专利]高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法

说明书

本发明涉及高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法。具体而言，本发明提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)SEQ ID NO:1第229～1035位核苷酸序列所示的序列；和(2)(1)所述序列的互补序列。本发明还提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)编码下式所示的多肽序列的多核苷酸序列：A‑L1‑B‑L2‑RML；式中，A可存在或不存在，当存在时，为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；L1在A存在时存在，为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；B为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；L2为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；RML表示米黑根毛霉脂肪酶的成熟肽序列；和(2)(1)所述序列的互补序列。

技术领域

本发明涉及高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法。

背景技术

脂肪酶(Lipase EC 3..1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业，是重要的工业酶制剂之一。其催化活性仅仅取决于它的蛋白质结构，因而不同来源的脂肪酶具有不同的催化特性和催化活力。

目前，已知大约有2％的微生物产脂肪酶，能产脂肪酶的微生物至少包括65个属，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属(Hasan，2006)。其中米黑根毛霉脂肪酶因具有较强sn-1,3选择性以及高活力的特性，已被广泛用于结构脂质(Structured lipids)的酶法合成，如SOS、OPO、DAG的合成，处理鱼油富集DHA等多不饱和脂肪酸(Pedersen，1995)，以及手性医药中间体及某些生物材料的制备(Fujikih，2009)等。

天然的米黑根毛霉脂肪酸产量低、成分不稳定，提取困难等存在较大的缺陷，使得其无法工业化生产。因此，针对RML的研究主要集中在其酶学性质、应用范围以及在基因工程菌中的高效表达。有关RML的报道中，诺维信(Novo)公司研究最为详实。1977年(Moskowitz，1977)，Novo公司研究员对天然RML进行了深入研究，结果表明：RML是一种糖蛋白，可广泛水解动物脂肪和植物油，在pH4-9范围内，室温下一定时间内保持稳定，其中pH6.0时最为稳定。1987年，Novo的Huge-jensen报道天然的米黑根毛霉发酵液中存在RML-A和RML-B两种具有高度免疫原性一致的酶，并阐明二者关系及一级结构。1988年(Boel，1988)，Novo公司Boel和Huge-jensen找到了编码RML的cDNA序列，并确定RML前体蛋白是由RML、70个氨基酸残基的前体肽链及24个氨基酸残基的信号肽构成，通过酶切割酶原蛋白的MET-SER之间的肽键而得到269个氨基酸残基的RML。1989年，Huge-jensen将RML的前体蛋白基因插入至米曲霉的载体中，利用α-淀粉酶基因的启动子和糖化酶的终止子进行表达得到胞外分泌的rRML。利用该表达载体得到的rRML中有70％的N-端氨基酸序列与天然酶一致，而另外的30％的重组酶比天然酶少一个丝苏氨酸残基。此外，重组酶的等电点为4.3与RML一致，含糖量为1.2％，免疫性质也与天然酶高度相似。目前Novo公司市场上销售的RML也是利用基因工程技术以米曲霉为载体表达的基因改性脂肪酶，液体酶商品名为20000L，固定化酶商品名为Lipozyme RM IM。尽管真菌米曲霉不失为一种优良的表达载体，但其自身会分泌各种非目标蛋白，如：Novo的Lipozyme RM酶液中非目的蛋白淀粉酶的含量远高于目的蛋白RML脂肪酶，另外，还有很多其他杂蛋白如：蛋白酶等，导致其应用受到很大限制。目前，尽管Novo将RML液体经过再次提纯，获得商品名为388的RML，但因价格昂贵，进一步限制了其在工业中的应用。

发明内容

本发明第一方面提供一种米黑根毛霉脂肪酶的编码序列，所述序列选自：

(1)SEQ ID NO:1第229～1035位核苷酸序列所示的序列；和

(2)(1)所述序列的互补序列。

本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：