[发明专利]即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，特别涉及一种不依赖于高能能量分子的恒温扩增技术。

背景技术

单核增生性李斯特菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单核增生性李斯特菌的携带率为0.6-16%，有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。一旦感染，轻则出现发烧、肌肉疼痛、恶心、腹泻等症状，重则出现头痛、颈部僵硬、身体失衡和痉挛等症状。受感染的孕妇可能出现早产、流产和死产，婴儿健康也可能受影响。因此，对食品中单核增生性李斯特菌的检测关系到人体的健康安全，急需要一种能即时检测出单增李斯特菌的方法。

单核增生性李斯特菌常用的检测方法有免疫金标试纸条法及聚合酶链式反应法，其中免疫金标试纸条法操作简单，检测结果快速且直观，但存在着灵敏度不足的缺点；而聚合酶链式反应法，在灵敏度和特异性等方面有优势，但存在着需要检测耗时较长，对检测人员的技术要求比较高等缺点。

与上述两种办法相比，本发明所运用的恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下（如37℃）进行核酸的扩增，因此不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。另外，恒温扩增体系有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远远高于传统PCR技术，所用时间更短，最短可以在5min内实现。由于恒温扩增技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其在项目上的应用越来越广泛。将恒温扩增技术应用在食品安全中单增李斯特菌的检测上，让单增李斯特菌的检测过程更加简便快捷。

发明内容

本发明的目的在于一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，包括反应液，启动液，反应酶系，单增李斯特菌hlyA基因特异性引物。

即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒反应液的具体成分如下：

Tris-HCl（pH8.3） 50mM

KCl 60mM

二硫苏糖醇2mM

甜菜碱1M

海藻糖5.5%

PEG 5.5%

BSA 0.1mg/mL

即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒启动液的具体组分如下：

氯化镁10mM

即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒反应酶系的具体组分如下：

dNTPs 200uM

聚合酶Bsu 50U

单链结合蛋白262ng/ul

重组酶（E.coli RecT） 360ng/ul

上游引物200nM

下游引物200nM

即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒特异性引物序列如下：

上游引物：CAACATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCC

下游引物：TGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGAC

即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒特异性探针序列如下：

CGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAG(FAM-dt)A(dSpacer)A(BHQ-dT)ACAAGGATTGGATTACA

本发明的有益效果：

本发明的恒温扩增体系，不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。

本发明的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在30 min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。

附图说明：

图1、图2、图3和图4为对应实施例的结果图，图中标记的编号即为对应反应管编号。

具体实施方式