[发明专利]即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其反应液组成如下：

Tris-HCl（pH8.3） 50mM

KCl 60mM

二硫苏糖醇2mM

甜菜碱1M

海藻糖5.5%

PEG 5.5%

BSA 0.1mg/mL

反应酶系和启动液各适量。

2.根据权利要求1所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其启动液组成如下：

氯化镁10mM。

3.根据权利要求1所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其反应酶系组成如下：

dNTPs 200uM

聚合酶Bsu 50U

单链结合蛋白262ng/ul

重组酶（E.coli RecT） 360ng/ul

上游引物200nM

下游引物200nM

荧光探针（如果需要）30nM

重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。

4.根据权利要求3所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，所采用的上游引物跟下游引物，其特征在于上游引物序列为：CAACATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCC；

下游引物序列为：TGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGAC。

5.根据权利要求1所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，基于恒温扩增反应试剂配合一种双色荧光标记的探针，可以进行即时荧光检测，所采用的荧光探针，其特征在于荧光探针序列为：CGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAG(FAM-dt)A(dSpacer)A(BHQ-dT)ACAAGGATTGGATTACA。

6.根据权利要求1所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于：Tris-缓冲液的pH为7～9，优选pH为8.3。

7.根据权利要求3所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于：重组酶选自E.coli RecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p¹⁴⁰/Exoǁ蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。

8.根据权利要求1-6所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于：恒温扩增的温度为37～42℃，优选扩增温度为37℃。

9.根据权利要求1-3所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于用氯化镁作为反应的启动液，浓度为5mM~20mM，优选浓度为10mM。