[发明专利]多肽探针、包含该探针的试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种多肽探针、包含该探针的试剂盒及其应用。所述多肽探针选自下列物质及其二聚体的组合物：X¹‑Y¹‑CC；其中，X¹为具有二聚化能力的多肽；Y¹选自待检测酶的酶切位点序列。该探针充分利用双砷染料‑四半胱氨酸标签复合物的稳定性和量子产率极度依赖于四半胱氨酸标签空间构象这一特性，进而发展了一种简单、灵敏测定酶活性的方法。

技术领域

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种多肽探针、包含该探针的试剂盒及其应用。

背景技术

细胞凋亡是一种由基因控制的细胞主动死亡过程，对多细胞生物个体的发育、正常细胞更新、组织保持正常结构与功能有着积极而重要的意义，异常细胞凋亡则会导致肿瘤、神经退行性疾病等疾病的发生。细胞凋亡的实施是由一系列半胱氨酸蛋白酶所引发的级联反应来实现的(Cold Spring Harb.Perspect.Biol.,2013,5(4):a008656)，在半胱氨酸蛋白酶家族中，半胱氨酸蛋白酶-3属于效应型凋亡酶，激活的半胱氨酸蛋白酶-3可降解一系列底物，包括凋亡抑制物、细胞外基质与骨架蛋白以及DNA修复相关因子，使细胞生化以及形态学发生改变，导致细胞凋亡(Oncogene,2008,27(48):6194-6206)。半胱氨酸蛋白酶-3是细胞凋亡执行阶段的关键蛋白酶，因此可以通过测定半胱氨酸蛋白酶-3的活性来测定细胞凋亡过程。

双砷染料-四半胱氨酸标签体系是一种具有广阔应用前景的活细胞蛋白荧光标记方法(Science,1998,281(5374):269-272)。在该系统中，四半胱氨酸标签是一个包含四个半胱氨酸残基的六肽或十二肽(Nat.biotechnol.,2005,23(10):1308-1314)，半胱氨酸残基两两结合在一起，形成半胱氨酸-半胱氨酸二联子，这两个二联子被脯氨酸-甘氨酸二联子分隔开来。四半胱氨酸标签对双砷染料具有较高的特异性和亲和力。双砷染料在被1,2-乙二硫醇螯合的情况下不发荧光，但是一旦与四半胱氨酸标签结合就会发出很强的荧光。除了以线性方式存在外，四半胱氨酸标签中的两个半胱氨酸-半胱氨酸二联子还可以被分离开来，但是它们在空间上必须相临近(Nat.Chem.Biol.,2007,3(12):779-784)。在该标记系统中，四半胱氨酸标签的空间构象会对所形成双砷染料-四半胱氨酸标签复合物的稳定性和量子产率产生极大的影响(J.Am.Chem.Soc.,2002,124(21):6063-6076)。

半胱氨酸蛋白酶-3通常以无活性的酶原存在细胞中，需要被上游的激活型凋亡酶切割而得以活化。激活的半胱氨酸蛋白酶-3可以特异性切割天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸四肽序列，根据这一特性，一系列基于天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸的探针被开发出来用于测定半胱氨酸蛋白酶-3的活性，对应的方法有荧光检测法、电化学法、比色法、表面等离子体共振法、生物发光法、电致化学发光法。随着纳米技术的发展，一些基于纳米材料的多肽探针如量子点复合多肽探针、纳米金复合多肽探针、石墨烯复合多肽探针也被开发出来用于测定半胱氨酸蛋白酶-3的活性(Chem.rev.,2015,115(22):12546-12629)。此外，一些基于荧光共振能量转移反应的蛋白探针以及荧光开关(Nat.Commun.,2013；，4:2157)也被开发出来用于测定细胞内半胱氨酸蛋白酶-3的活性。在这些方法中，荧光标记会在一定程度上降低半胱氨酸蛋白酶-3对底物的切割效率，制备纳米传感器则使得检测过程变得复杂和低效。因此迫切需要发展简单、灵敏、高效的方法来测定细胞内半胱氨酸蛋白酶-3活性从而来检测细胞凋亡过程。此外，本领域在检测其它酶的活性时也或多或少的存在上述问题，且缺乏一种高效的可针对各种酶的活性进行检测的技术。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

在本发明中，我们充分利用双砷染料-四半胱氨酸标签复合物的稳定性和量子产率极度依赖于四半胱氨酸标签空间构象这一特性，设计了一种新型无标记多肽分子探针，进而发展了一种简单、灵敏测定酶活性的方法。