[发明专利]重组单链人FVIII-Fc融合蛋白及其应用

说明书

本发明提供了一种重组单链人FVIII‑Fc融合蛋白，其中，FVIII是B结构域缺失的人FVIII；Fc来自包含N297G突变的人IgG1，两个CH2‑CH3结构域通过柔性多肽连接成一条单链，在靠近N端的CH3中引入T366S、L368A和Y407V突变，在靠近C端的CH3中引入T366W突变。本发明提供的重组单链人FVIII‑Fc融合蛋白达到了与市售的重组FVIII相当的凝血活性，而且半衰期延长。另外，由于在Fc链内引入了点突变，本发明的融合蛋白不会形成同源二聚体，融合蛋白的产量大大提高，而且能够通过常规的protein A纯化工艺获得目的蛋白，大大降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及重组FVIII-Fc融合蛋白领域，更具体地涉及B结构域缺失的人FVIII与特定的单链Fc连接形成的融合蛋白。

背景技术

A型血友病是由凝血因子VIII(FVIII)活性的缺乏或功能障碍造成的一种遗传性出血障碍。补充有活性的FVIII是治疗A型血友病的有效措施。内源的FVIII的循环半衰期是12-14小时，因而每周需要进行几次预防性治疗，为了提高患者的依从性，减少FVIII每周施用的次数，研究者一直致力于开发半衰期延长的FVIII。

利用活性蛋白与IgG的Fc结构域连接构成融合蛋白来延长活性蛋白在体内的半衰期，是目前本领域技术人员常采用的手段之一。但是早期的Fc融合蛋白均是将两个活性蛋白与一个Fc片段融合形成二价分子。FVIII不仅分子量较大，是目前重组技术表达的分子量最大的活性蛋白，并且其需要与磷脂、FIXa和FX形成复合物才能发挥凝血活性，因此，二价分子形式的FVIII-Fc蛋白会由于空间位阻效应而导致FVIII活性降低或丧失。

专利CN201080062950.7公开了一种嵌合FVIII-Fc蛋白，其中所述嵌合蛋白包含两条链，一条链包括FVIII与IgG1的铰链区-CH2-CH3，另一条链仅包括IgG1的铰链区-CH2-CH3，二条链通过Fc区二聚化而形成杂合蛋白。但是，在该嵌合蛋白生产过程中，由于可同时产生“铰链区-CH2-CH3”同源二聚形式的分子，因此嵌合FVIII-Fc的产量极低，而且不能通过常规的protein A纯化工艺获得目的蛋白，只能采用VIIIselect(GE Healthcare)来纯化，从而极大的增加了生产成本。

发明内容

本发明目的在于提供一种新的重组单链人FVIII-Fc融合蛋白，其中Fc片段中的两个CH2-CH3结构域通过柔性多肽连接成一条单链。并采用真核细胞表达系统进行融合蛋白表达。所表达的重组单链人FVIII-Fc可用常规protein A纯化工艺获得较高纯度蛋白。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种重组单链人FVIII-Fc融合蛋白，其中，FVIII是B结构域缺失的人FVIII；Fc来自包含N297G突变的人IgG1，两个CH2-CH3结构域通过柔性多肽连接成一条单链，在靠近N端的CH3中引入T366S、L368A和Y407V突变，在靠近C端的CH3中引入T366W突变。

优选地，所述FVIII与Fc直接连接或通过柔性多肽连接。

优选地，所述柔性多肽由至少一种选自G、S、A、T的氨基酸组成。

优选地，重组单链人FVIII-Fc融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.1。

本发明还提供了编码序列为SEQ ID NO.1的重组单链人FVIII-Fc融合蛋白的核酸，其序列为SEQ ID NO.2。

本发明还提供了包含上述的核酸的表达载体。

本发明还提供了表达前述的重组单链人FVIII-Fc融合蛋白的细胞株。

本发明还提供了一种组合物，其包含前述的重组单链人FVIII-Fc融合蛋白，和药学上可接受的载体。