[发明专利]一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，特别是涉及一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法，包括获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管、利用淋巴细胞分离液Ficoll‑1077进行外周血单核细胞（PBMC）的分离、利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzol RT、RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA 5’端添加接头、PCR1、PCR2和纯化和进行高通量测序等步骤。通过从接头的上游引物到C区的下游引物，获得淋巴细胞中TCR（Alpha链或Beta链）和BCR（Heavy链或Light链）的基因序列的全长信息。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，特别是涉及一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法。

背景技术

T、B细胞基因座上大量的V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)基因片段在T、B细胞受体的形成中会产生各种多样性重组。这种V-D-J基因的重组赋予了每一种T、B细胞自己独特的T、B细胞受体(TCR、BCR)，从而使得每一个TCR和BCR的序列能有效的成为一个T、B细胞克隆的唯一生物标志物。

由于TCR和BCR基因的最大特点是V、D、J基因片段的随机重组，所以，针对未知基因序列，很难设计一个上游引物用于识别TCR、BCR基因的5’端序列，所以也无法利用PCR技术扩增TCR、BCR基因和测序。

而另外一种TCR测序方法，多重引物PCR的方法，只能测序TCR基因中的部分序列信息，这样使得测序基因信息不完整。另外，多重引物PCR方法的引物是根据已知V，J基因设计的，这种测序结果只局限于野生型的已知基因。但在癌症病人中，癌细胞的基因突变是很常见的，如果白血病癌细胞的BCR或TCR产生了突变，那么已知序列的引物就有可能无法识别突变后的基因，对检测结果来说，就容易造成假阴性。并且，多重引物PCR的免疫组库测序方法，仅仅对TCR或者BCR测序，就已经需要几十对的引物，如果同时检测TCR和BCR的话，庞大的引物数量会让整个PCR扩增的效率和特异性变得很差。

所以，目前还没有一个技术可以在一次实验操作中同时检测TCR和BCR，利用我们的方法(单对引物法)可以同时检测多个样本的TCR和BCR，节约实验时间和试剂、人工成本。该技术可以应用在免疫基因组学的研究中，不仅能够检测淋巴恶性肿瘤治疗后的微小残留病，还能够评判HSC移植后的免疫重建、食物过敏、免疫性疾病的检测等等。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种基于高通量测序同时构建T细胞受体和B细胞受体文库构建的cDNA接头和单对引物，以及文库制备方法，通过从接头的上游引物到C区的下游引物，同时获得TCR和BCR基因序列的全长信息。

解决以上技术问题的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；

(2)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077(美国Sigma公司#10771)进行外周血单核细胞(PBMC)的分离；

淋巴细胞分离液的作用在于可以从全血里分离淋巴细胞，因为T细胞为我们检测对象，T细胞属于淋巴细胞的一种，分离后的细胞群所获得的RNA是除去了红细胞、血小板等细胞的RNA的。所以建库使用的总RNA内含T细胞RNA模板纯度更高。

(3)利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzol RT(美国MRC公司#RN190)；

Trizol的方法提取RNA,步骤如下：

收获细胞，转移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。

加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。