[发明专利]一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法

权利要求书

1.一种基于高通量测序同时检测T细胞(TCR)和B细胞(BCR)免疫组库的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；

(2)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077进行外周血单核细胞(PBMC)的分离；

(3)利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzol RT；

(4)RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA 5’端添加接头；接头为XCR 5’ Oligo接头，其碱基序列为：5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG 3’；

(5)PCR1:通过1条上游引物、2条或2条以上的下游引物的方式扩增重组TCR和BCRcDNA；PCR 1反应程序为:95℃3分钟；95℃30秒；65℃1分钟，25循环；72℃1分钟；4℃永久；

(6)PCR2和纯化：为PCR1产物添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时扩增,并利用磁珠进行DNA纯化；PCR 2反应程序为:94℃3分钟；94℃30秒；55℃30秒，18循环；72℃20分钟，72℃1分钟，4℃永久；

(7)进行高通量测序：将所得的cDNA文库通过Illumina MiSeq平台进行测序，测序模式为PE300，文库变性浓度为2nM，上机浓度为20pM，并通过生物信息学分析高通量测序结果。

2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，具体步骤如下：

按照以下比例混合每一个RNA样本：

试剂 体积1X(μL)，

RNA 8，

XCR 3’Oligo(dT)引物(10μM) 1，

孵化于72℃3分钟，接着4℃1分钟；

按照以下比例制备PCR反应缓冲液：

3.根据权利要求2所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法，其特征在于：混合所述PCR反应缓冲液与RNA样本，按照下面反应程序开始cDNA反转录：42℃60分钟；70℃10分钟；4℃永久。

4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，按照以下比例制备反应体系：

5.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，按照以下比例制备反应体系：

6.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，具体纯化步骤如下：

(1)添加80μL AMPure XP Beads进入PCR2反应产物，混匀；

(2)在室温孵化10分钟；

(3)放置磁珠-PCR2产物混合物试管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丢弃；

(4)添加150μL 70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丢弃；

(5)重复第四步2次；

(6)打开试管盖，等待5分钟，待磁珠风干，没有任何乙醇残留于试管内；

(7)把试管从磁力架上取下，并添加50μL去核酸酶水，利用移液器吹打悬浮磁珠；

(8)把试管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，转移上清液于新的试管中，上清液里就包含了纯化之后的PCR2产物。