[发明专利]一种兜兰质粒子房注射法转基因方法

说明书

本发明公开了一种兜兰质粒子房注射法转基因方法。它是将含有携带有目的基因的植物表达载体的质粒注射液注射到兜兰授粉后且完成双受精前的子房内，然后将发育成的种子作为外植体进行无菌播种，经原球茎的诱导、抗性原球茎的筛选及分子检测获得转基因兜兰植株。本发明的兜兰质粒子房注射法转基因方法具有操作简单、结果率高和转化率高的优点，有利于兜兰的分子育种及加速兜兰的育种进程。

技术领域：

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种兜兰质粒子房注射法转基因方法。

背景技术：

兜兰(Paphiopedilum)由于其独特的花朵造型、绚丽的花朵色彩、持久的观赏花期而具有极高的观赏价值，是国际花卉市场上十分流行的高档花卉。但由于人们对兜兰的过度采挖和生境的破坏，兜兰已成为世界上最濒危的植物物种之一，所有野生种类均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录I而被禁止贸易。通过各种育种方法能选育出在国际市场上自由交易、观赏价值高的兰花新品种来满足市场需要。兰科植物的转基因的方法有农杆菌介导法和基因枪法等，主要种类包括石斛兰、蝴蝶兰、文心兰和兰属植物等，但农杆菌介导法和基因枪法等均需建立在有效的再生体系的基础上。然而，兜兰属植物的再生体系难以建立，国内外还没有兜兰农杆菌介导法和基因枪法转基因方法的报道。利用质粒子房注射法能有效地解决这个问题。

兰科植物种子数量巨大，一般一个果荚中种子量在数万至数十万个以上，应用质粒子房注射法进行活体遗传转化时，即使转化效率较低，也能获得较多的转化植株。但兰科植物从授粉到受精过程一般需要几十天，而在受精前的短暂时期，由于生殖细胞或者受精卵没有细胞壁或者细胞壁比较薄弱，处于较为敏感的感受态，较容易被转化，因此选择合适的注射时间是子房注射法转基因成功的关键。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种兜兰质粒子房注射法转基因方法。

本发明的兜兰质粒子房注射法转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)质粒子房注射：对兜兰进行人工授粉，选择授粉后45～70天的子房进行表面消毒，然后沿子房纵向垂直将质粒注射液注射到子房内部，注射量为20～30μL，注射后对注射部位进行密封；所述的质粒注射液含有200～400μg/mL的携带目的基因的植物表达载体和体积分数1％～3％的二甲基亚砜，其余为水；所述的植物表达载体携带有抗性基因；

2)抗性植株筛选和检测：摘取授粉后180～210天的注射有质粒注射液的蒴果进行无菌播种，将蒴果进行消毒处理，无菌条件下剖开蒴果，取出种子并进行消毒，然后将种子悬浮于无菌水中制成种子悬浮液播种到改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，种子萌发形成原球茎，将原球茎转接至含有与植物表达载体携带的抗性基因相对应的抗生素的改良H26号培养基上进行连续筛选，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，获得抗性原球茎，将抗性原球茎转接到改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养至形成小苗，经分子检测获得转基因兜兰植株；

所述的改良H26号培养基为：每升培养基含有花宝1号1～2g、蔗糖10～20g、蛋白胨1～3g、酪氨酸1～3g、琼脂5～6g、活性炭1.0～2.0g、维生素B₁ 10mg、维生素B₆ 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、磷酸二氢钠150～200mg、萘乙酸0.5～1mg和椰子汁50～100mL，余量为水。

所述的抗性基因优选为潮霉素抗性基因。

所述的植物表达载体优选为pCAMBIA1301。

所述的兜兰为梦想兜兰(Paphiopedilum SCBG Dream)。

所述的目的基因优选为建兰CeFT基因。