[发明专利]一种兜兰质粒子房注射法转基因方法

权利要求书

1.一种兜兰质粒子房注射法转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)质粒子房注射：对梦想兜兰进行人工授粉，选择授粉后60～70天的子房进行表面消毒，然后沿子房纵向垂直将质粒注射液注射到子房内部，注射量为20～30μL，注射后对注射部位进行密封；所述的质粒注射液含有300～400μg/mL的携带目的基因的植物表达载体和体积分数2％～3％的二甲基亚砜，其余为水；所述的植物表达载体携带有抗性基因；

2)抗性植株筛选和检测：摘取授粉后180～210天的注射有质粒注射液的蒴果进行无菌播种，将蒴果进行消毒处理，无菌条件下剖开蒴果，取出种子并进行消毒，然后将种子悬浮于无菌水中制成种子悬浮液播种到改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，种子萌发形成原球茎，将原球茎转接至含有与植物表达载体携带的抗性基因相对应的抗生素的改良H26号培养基上进行连续筛选，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，获得抗性原球茎，将抗性原球茎转接到改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养至形成小苗，经分子检测获得转基因兜兰植株；

所述的改良H26号培养基为：每升培养基含有花宝1号1～2g、蔗糖10～20g、蛋白胨1～3g、酪氨酸1～3g、琼脂5～6g、活性炭1.0～2.0g、维生素B₁ 10mg、维生素B₆ 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、磷酸二氢钠150～200mg、萘乙酸0.5～1mg和椰子汁50～100mL，余量为水。

2.根据权利要求1所述的兜兰质粒子房注射法转基因方法，其特征在于，所述的抗性基因为潮霉素抗性基因。

3.根据权利要求1～2任一项所述的兜兰质粒子房注射法转基因方法，其特征在于，所述的植物表达载体为质粒pCAMBIA1301。

4.根据权利要求1所述的兜兰质粒子房注射法转基因方法，其特征在于，所述的目的基因为建兰CeFT基因。

5.根据权利要求1所述的兜兰质粒子房注射法转基因方法，其特征在于，所述的将蒴果进行消毒处理具体为将蒴果用体积分数70％～80％的酒精浸泡1～2分钟，再用质量分数0.1％～0.2％的升汞溶液浸泡消毒10～20min，无菌水冲洗3～5次。

6.根据权利要求2所述的兜兰质粒子房注射法转基因方法，其特征在于，所述的将原球茎转接至含有与植物表达载体携带的抗性基因相对应的抗生素的改良H26号培养基上进行连续筛选，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，获得抗性原球茎具体为：将原球茎转接至含30～50mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养50～65d时将存活的原球茎转接至含40～60mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养50～65d时将存活的原球茎转接至含40～60mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养50～65d后将存活的原球茎转接至含30～50mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养50～65d天后获得抗性原球茎。