[发明专利]荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法

说明书

本发明公开了一种荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，应用心肌细胞选择性地结合荭草花提取物中的活性成分，洗去未结合的其他成分后，使细胞靶点失活，被结合的活性成分从心肌细胞中释放出来，然后采用UHPLC‑Q‑TOF/MS技术进行分析鉴定。本发明的优点是：采用特定的H9c2心肌细胞，能够特异地、有选择性地与荭草花提取物中的活性成分结合，可以满足中药作用多靶点的活性成分的筛选，并且采用UHPLC‑Q‑TOF/MS系统建立了生物样品中可靠的定性分析方法，能够较全面地反映心肌细胞萃取溶液中的药物成分，为快速确定荭草花药效物质基础及创新药物研究提供参考。

技术领域

本发明涉及药物分析领域，特别涉及一种荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法。

背景技术

生物活性筛选/化学成分在线分析技术是由生命科学与色谱、质谱分离鉴定技术交叉形成的一种综合技术，它是利用药物产生作用一般通过药物与靶点结合的原理，将酶、受体、离子通道、神经介质等在生命活动中起重要生理作用的活性生物大分子、活性细胞膜甚至活性细胞作为靶标，建立中药药效物质基础的生物活性筛选/化学成分在线分析方法。而细胞萃取可以利用细胞的选择性筛选与细胞结合的成分，与细胞结合的成分同效应成分之间具有显著的相关性，不同效应成分作用程度的差别或与靶标具有不同的结合性能，筛选研究中药的活性成分。

荭草为蓼科植物荭草Polygonum orientale L.的干燥全草，为贵州省地产药材，具有行气活血、消积、止痛的功效，在贵州民间和少数民族地区常用于胸痛、胸闷、气短、中风偏瘫(嘴角歪斜)、风湿疼痛等疾病的治疗。现有研究中发现“荭草花”水煮醇沉后的正丁醇萃取部位比全株“荭草”有着更明显的抗心肌缺血作用，为荭草的主要药用有效部位，但其在体内的药效物质基础尚不明确，有待进一步研究筛选，为其创新药物研究及深层次开发利用奠定基础。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种有效的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，包括以下步骤：将含有荭草花提取物的缓冲液加入到处于对数生长期的H9c2心肌细胞中培养，去除溶液，清洗；向清洗后的所述H9c2心肌细胞加入pH值为4的磷酸盐缓冲液进行振摇，离心，收集上清液调节pH值为4，上样于Oasis HLB小柱，先用甲酸水清洗小柱，再用甲醇冲洗小柱，收集甲醇洗脱液，浓缩干燥，再加入甲醇溶解，离心分离，取上部的澄清液用于UHPLC-Q-TOF/MS检测分析。UHPLC-Q-TOF/MS称为：超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪。

根据前期对荭草花化学成分研究的结果表明，荭草花主要含有酚酸、黄酮等偏酸性化学成分，为了使上述成分能从含有荭草花提取物的缓冲液中游离出来并以分子状态存在于溶液中，故选择pH值为4的磷酸盐缓冲液进行振摇结合，并调整上样液的pH值也为4。

本发明中，将荭草花提取物溶于缓冲液中，在于让荭草花提取物溶液接近细胞内的环境，缓冲液的电解质和pH值等适宜正常细胞的生长发育。

优选的，所述荭草花提取物的制备方法包括以下步骤：取荭草花加水煎煮，所得煎煮液浓缩至1.04～1.05，加入乙醇至溶液的含醇量达65％以上，混匀，静置，过滤，所得滤液浓缩至1.04～1.05，然后加入正丁醇萃取，将正丁醇萃取液浓缩，得萃取物；将所述萃取物用乙醇溶解，上样于聚酰胺层析柱，用80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得荭草花提取物。

优选的，所述煎煮的次数为3次；每次所述煎煮的时间为1小时；每次所述煎煮时，加水的重量为所述荭草花重量的10倍。

优选的，所述含有荭草花提取物的缓冲液是将荭草花提取物溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，过滤，得浓度为2mg/ml的溶液。